Диагностикум эритроцитарный сальмонеллезный ви антигенный жидкий. Диагностикум эритроцитарный сальмонеллезный ви-антигенный. Эритроцитарный диагностикум из шигелл Зонне

Набор реагентов Диагностикум Сальмонеллезный ВИ-антигенный предназначен для выявления в сыворотке крови человека специфических антител к Ви-антигену сальмонелл тифа в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА).

ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА

2.1. Принцип метода.

Действующим началом Диагностикум Сальмонеллезный ВИ-антигенный является Ви-антиген, фиксированный на поверхности эритроцитов. При взаимодействии с сыворотками, содержащими антитела к Ви-антигену, наблюдается феномен агглютинации эритроцитов.

2.2. СОСТАВ НАБОРА

Реагенты	Количество
Диагностикум эритроцитарный сальмонеллезный Ви-антигенный жидкий — представляет собой 1% взвесь формалинизированных и сенсибилизированных Ви-антигеном сальмонелл тифа эритроцитов барана в фосфатном буферном растворе (рН 7,2 + 0,2; концентрация 0,06 моль/л). Гомогенная суспензия коричневого цвета без хлопьев; при отстаивании образуется 2 слоя: плотный коричневый осадок эритроцитов и прозрачная желтоватая надосадочная жидкость	1 флакон — 6 мл
Сыворотка диагностическая сальмонеллезная адсорбированная рецептор Ви сухая — гомогенная масса от белого с коричневатым оттенком до бежевого цвета	1 флакон – из 0,1 мл
1 % взвесь формалинизированных, несенсибилизированных эритроцитов барана — гомогенная суспензия коричневого цвета без хлопьев; при отстаивании образуется 2 слоя: плотный коричневый осадок эритроцитов и прозрачная желтоватая надосадочная жидкость	1 флакон –
Раствор для разведений сыворотки и постановки РПГА — 0,9 % раствор натрия хлорида — прозрачная бесцветная жидкость, рН от 6,5 до 7,5	2 флакона – по 8 мл
Планшет круглодонный для иммунологических реакций однократного применения — состоит из 8 рядов, каждый из которых включает в себя 12 лунок с прозрачным, бесцветным, круглым дном	1 шт

АнаЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ.

3.1. Диагностикум должен агглютинироваться в РПГА сывороткой диагностической сальмонеллезной адсорбированной рецептор Ви сухой в разведении не менее чем 1:160.

Условным уровнем диагностической характеристики сыворотки крови здоровых людей следует считать разведение сыворотки не выше 1:20.

3.2. Время проведения анализа – 2 ч.

3.3. Набор рассчитан на 8 определений.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

При работе с набором следует соблюдать «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР (М., 1981 г.).

Анализируемые сыворотки, а также находящиеся с ними в контакте реагенты следует рассматривать как потенциально инфицированные, способные длительное время сохранять или передавать ВИЧ, вирус гепатита или любой другой возбудитель вирусной инфекции — обращаться с ними следует осторожно:

работать в резиновых перчатках;
при пипетировании необходимо пользоваться автоматическими дозаторами;
при завершении работы анализируемые сыворотки и находящиеся с ними в контакте реагенты, инструменты подвергать обработке дезинфицирующим раствором
оборудование до и после работы протирать 70 % этиловым спиртом.

Анализируемые сыворотки должны быть инактивированы при температуре 56 0 С в течение 30 мин.

Входящая в состав набора сыворотка диагностическая сальмонеллезная адсорбированная рецептор Ви сухая инактивирована.

Объективные результаты анализа гарантируются при выполнении следующих условий:

хранение всех реагентов набора осуществлять при температуре от 2 до 8 0 С;
не использовать реагенты с истекшим сроком годности;
не использовать реагенты набора при отсутствии на их упаковке соответствующей маркировки;
для проведения РПГА использовать реагенты, входящие только в данный набор.

Vi-Диагностикум

Диагностикум Ви

Vi-Антигеннный

ДИАГНОСТИКУМЫ (греч, diagnostikos способный распознавать) - взвеси обезвреженных микроорганизмов, используемые в качестве антигенов для серологических реакций. Опасность работы с живыми культурами, их способность к изменчивости и наличие широких антигенных связей делают целесообразным применение Д.- более стандартных и гомогенных препаратов, содержащих определенные антигенные компоненты.

С помощью Д. в реакциях агглютинации, пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА) и др. выявляют специфические антитела в сыворотках людей и животных с целью постановки диагноза и изучения иммунного состояния организма.

Особенно широко используют Д. в лабораторных исследованиях при кишечных инфекциях. Однако общность антигенной структуры кишечных бактерий обусловливает наличие перекрестных реакций и требует дифференцированного выявления антител. С этой целью проводят избирательное подавление отдельных антигенов: с помощью фенола или формалина подавляют О-агглютинабельность, как предложили Феликс и Олицкий (A. Felix, L. Olitzki, 1928). Воздействуя спиртом по способу Вина и Зонтага или прогреванием по Кауффманну, получают O-диагностикумы с инактивированным жгутиковым антигеном. Еще более перспективно применение моно диагностикумов, принцип создания которых разработан Ф. Г. Бернгофом (1944). В этих препаратах содержится лишь один антигенный компонент, и они взаимодействуют только с определенными специфическими антителами.

Показана возможность сохранения свойств бактериальных Д. путем их лиофилизации (см.).

Д., применяемые для серодиагностики различных инфекций, принципиально сходны, однако отдельные виды этих препаратов имеют определенную специфику.

Общепризнано, что РПГА более чувствительна и специфична, чем бактериальная агглютинация. В качестве антигенов в РПГА применяют формалинизированные эритроциты, сенсибилизированные антигенами, полученными по методам Буавена и Вестфаля.

Возможно также использование эритроцитарных Д. для выявления антигена в тканях, выделениях больных, экстрактах различных веществ и т. п. В этих случаях применяют эритроциты, сенсибилизированные антителами,- «антительные диагностикумы».

Вирусные Д. применяют в основном в реакции связывания комплемента (РСК), РТГА и реакции нейтрализации. Готовят их из вируссодержащих культуральных жидкостей, обработанных (инактивированных) различными способами.

Краткая характеристика основных Д. и сфера их применения представлены в таблице.

Имеются также экспериментальные препараты, используемые в научной работе: эритроцитарные колидиагностикумы, дифтерийные эритроцитарные Д., гемагглютинирующие антигены вирусов паротита, коревой Гемагглютинирующий антиген и др.

Таблица. Краткая характеристика основных диагностикумов и цель их применения

Диагностикумы	Краткая характеристика	Цель применения (используется сыворотка обследуемого)
Бактериальные диагностикумы
Диагностикумы из бактерий семейства кишечных: шигелл Флекснера, Зонне, Ньюкасла; сальмонелл тифа (ОН, О), паратифа А и В, холеры су ис, тифимуриум, энтеритидис	Микробная взвесь (3 млрд. микробных тел в 1 мл), инактивированная 0,4-0,5% р-ром формалина	Постановка реакции агглютинации для уточнения клин, диагноза заболевания
Сальмонеллезные О-диагностикумы (2, 4, 7, 8, 9 и 3, 10)	Микробная взвесь, содержащая парциальный О-антиген (3 млрд. микробных тел в 1 мл),полученная из селекционированных штаммов, инактивированная 15% р-ром глицерина	Постановка реакции агглютинации для выявления О-антител при сальмонеллезах
Сальмонеллезные Н-монодиагностикумы (а, b, с, d, eh, с, k, lv, gm, p, st и антигены второй фазы - 1, 2, 5, 6, 7)	Микробная взвесь, содержащая компоненты жгутикового антигена 1-й и 2-й фаз (3 млрд. микробных тел в 1 мл), полученная из селекционированных штаммов, инактивированная 0,5% р-ром формалина	Постановка реакции агглютинации для выявления Н-антител с диагностической целью и для установления заболевания в анамнезе
Vi-диагностикум	Микробная взвесь (3 млрд. микробных тел в 1 мл) из штаммов, содержащих Vi-фактор, обработанная 0,4% р-ром формалина и 0,6% р-ром хлорида кальция	Постановка реакции агглютинации для выявления брюшнотифозного бактерионосительства
Бруцеллезный единый диагностикум	Взвесь бруцелл в 12% р-ре поваренной соли, окрашенная в синий цвет и инактивированная 0,5% р-ром фенола	Постановка реакции агглютинации (реакция Райта и реакция Хаддлсона для выявления инфицированных людей и животных- см.Бруцеллез, методы исследования)
Туляремийный диагностикум	Микробная взвесь (25 млрд. микробных тел в 1 мл) вакцинного штамма, инактивированная 0,5% р-ром формалина	Постановка объёмно-капельной реакция агглютинации на стекле для серодиагностики и изучения иммунного состояния привитых
Лептоспирозные диагностикумы	Лиофилизированная микробная взвесь 11 штаммов наиболее распространенных серотипов	Постановка РСК для подтверждения клин, диагноза заболевания
Риккетсиозные диагностикумы	Корпускулярные антигены - взвесь риккетсий, выращенная в желточных мешках куриных эмбрионов или легочнориккетсиозный материал от зараженных грызунов, обработанный эфиром, целитом или при дифференциальном центрифугировании	Постановка реакции агглютинации для дифференциальной диагностики риккетсиозов
Эритроцитарные диагностикумы
Эритроцитарные диагностикумы из шигелл Флекснера - Зонне	Формалинизированные эритроциты, сенсибилизированные антигенами Буавена, Вестфаля и др.	Постановка РПГА для уточнения клин» диагноза дизентерии
Эритроцитарный сальмонеллезный Vi-диагностикум	Формалинизированные эритроциты, сенсибилизированные очищенным Vi-антигеном	Постановка РПГА для выявления брюшнотифозного бактерионосительства
Эритроцитарные сальмонеллезные О-диагностикумы (1, 2, 12; 1, 4, 12; 6, 7; 6, 8; 1, 9, 12; 3, 10 и комплексный)	1% взвесь формалинизированных эритроцитов, сенсибилизированных антигенами Буавена, Вестфаля и др.	Постановка РПГА для уточнения клин» диагноза заболевания
Лиофилизированный туляремийный эритроцитарный диагностикум	Формалинизированные лиофилизированные эритроциты, сенсибилизированные туляремийным антигеном	Постановка РПГА для уточнения клин., диагноза туляремии, а также реакции нейтрализации антител для обнаружения: антигена
Вирусные диагностикумы
Антиген вируса осповакцины	Сухой препарат живого вируса осповакцины, культивированного на хорион-аллантоисной оболочке куриных эмбрионов	Постановка РПГА для выявления антигемагглютининов у больных и привитых
Аденовирусный специфический антиген	Готовят культивированием вируса 6 типа в культуре перевиваемых клеток А-1 (антиген, общий для всех аденовирусов)	Постановка РСК для выявления комплементсвязывающих антител в сыворотке больных
Диагностикумы клещевого энцефалита и этиологически сходных с ним заболеваний		Постановка РСК и РТГА для уточнения клин, диагноза заболевания
Орнитозный антиген	Сухой препарат из кипяченых вируссодержащих желточных мешков куриных эмбрионов, экстрагированных эфиром, осажденных ацетоном и инактивированных мертиолатом	Постановка РСК для диагностики орни-тоза людей, птиц и животных
Гриппозный диагностикум сухой	Аллантоисная жидкость развивающихся куриных эмбрионов, инфицированных одним из штаммов вируса гриппа типа А, В или С, инактивированная формалином, мертиолатом. В связи с изменчивостью антигенной структуры вируса гриппа предусмотрена частая смена производственных штаммов	Постановка РТГА для уточнения клин., диагноза заболевания
Парагриппозный диагностикум типа 1, 2, 3 для РТГА, сухой	Культуральная жидкость (почки эмбриона человека), содержащая один из штаммов вируса парагриппа, обработанная твином-80, эфиром и мертиолатом	Постановка РТГА для уточнения клин, диагноза заболевания

Библиография: Зуев А. С. Бактериальный vi-диагностикум для выявления хронических носителей брюшнотифозных бактерий, Журн, микр., эпид, и иммун., № 2, с. 51, 1959, библиогр.; Зуев А. С., Новоселова А. И. и Ликина И. В. Разработка методики производственного изготовления О-диагностикумов и Н-монодиагностикумов и применение их при серодиагностике салмонеллезов, там же, № 3, с. 42, 1956; Иммунология и профилактика кишечных инфекций, под ред. С. И. Диденко, с. 180, М., 1962; Каральник Б. В. Эритроцитарные диагностикумы, М., 1976; Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней, под ред. К. И. Матвеева, с. 172, М., 1973; Субботина Ю. Л. и д р. Серологическая диагностика сальмонеллезов и антигенные связи в реакциях с эритроцитарными и бактериальными О-диагностикумами, Журн, микр., эпид, и иммун., № 3, с. 19, 1970, библиогр.

Л. Б. Богоявленская.

Регистрационное удостоверение № РЗН 2016/3905 от 04.04.2016 г.

Назначение

Набор реагентов "Диагностикум эритроцитарный сальмонеллезный Vi-антигенный для РПГА" (СЭД-Vi) предназначен для выявления антител к Vi-антигену возбудителя брюшного тифа в сыворотках крови людей реакцией пассивной гемагглютинации (РПГА).

Характеристика набора

Принцип действия

При наличии антител к возбудителю брюшного тифа наблюдается гемагглютинация сенсибилизированных Vi-антигеном куриных эритроцитов, что приводит к образованию на дне U-образных лунок планшета "зонтика" из осевших эритроцитов. При отсутствии антител к возбудителю брюшного тифа осевшие эритроциты образуют "точку".

Состав набора

Наименование реагента	Описание	Количество в наборе
Диагностикум эритроцитарный сальмонеллезный Vi-антигенный, сухой 6 % (СЭД)	Формалинизированные куриные эритроциты, сенсибилизированные Vi-антигеном S.typhi. Сухая гигроскопическая масса коричневого цвета. После растворения — суспензия красно-коричневого цвета.	1 фл., из 0,6 мл
Сыворотка диагностическая сальмонеллезная адсорбированная, рецептор Vi, сухая (в разведении 1:20, (К+))	Кроличья сыворотка сальмонеллезная адсорбированная, рецептор Vi, в разведении 1:20. Сухая гигроскопичная пористая масса белого цвета. После растворения — прозрачная жидкость желтоватого цвета или бесцветная.	1 фл., из 0,3 мл
Разбавитель исследуемых проб (РИП)	Прозрачная жидкость сине-фиолетового цвета.	1 фл., 10 мл
Фосфатный буферный раствор (ФБР)	Прозрачная бесцветная жидкость.	1 фл., 10 мл
Планшет полимерный для иммунологических реакций однократного применения	Планшет полимерный для иммунологических реакций однократного применения из прозрачного бесцветного полистирола.	1 шт.

Диагностические характеристики

Диагностикум должен агглютинироваться в РПГА сывороткой диагностической сальмонеллезной адсорбированной, рецептор Vi, сухой (в разведении 1:20), до титра, указанного на этикетке сыворотки. Условным уровнем диагностической характеристики сыворотки крови здоровых людей следует считать разведение сыворотки не выше 1:20. Время проведения анализа - 3040 минут. Набор рассчитан на исследование 42 сывороток крови в варианте скрининга или 10 сывороток крови в варианте их титрования.

Меры предосторожности

Набор предназначен только для in vitro диагностики. Входящие в компоненты набора вещества инактивированы и безопасны. При работе с набором следует соблюдать СП 1.3.2322-08 и СанПиН 2.1.7.2790-10.

Дополнительное оборудование и материалы

Оборудование, материалы, растворы:

дозаторы пипеточные 1-канальные с варьируемым объёмом дозирования 5 — 40 мкл; 40 — 200 мкл; 200 — 1000 мкл и 1000 — 5000 мкл;
дозаторы пипеточные 8- или 12-канальные с варьируемым объемом дозирования 5 — 40 мкл и 40 — 200 мкл;
вода дистиллированная (ГОСТ 6709-72).

Анализируемые образцы

Исследуемые образцы сыворотки крови хранят при температуре от 2 до 8 °С не более 3 суток от момента взятия крови. Допускается хранение сыворотки в замороженном состоянии при температуре не выше минус 18 °С не более 1 года. Перед использованием образцы размораживают при температуре от 16 до 25 °С и перемешивают встряхиванием. Повторное замораживание не допускается. Нельзя использовать образцы с бактериальным проростом и гемолизом. Перед постановкой реакции испытуемые сыворотки прогревают при 56 °С в течение 30 минут.

Проведение анализа

Подготовка контрольной диагностической сыворотки (К+)

Готовят рабочий раствор сыворотки диагностической сальмонеллезной адсорбированной, рецептор Vi, сухой (в разведении 1:20) из 0,3 мл (К+). Для этого к содержимому флакона с К+ добавляют 0,3 мл фосфатного буферного раствора (ФБР). Оставшееся количество сыворотки можно аликвотировать и хранить в замороженном состоянии при температуре не выше минус 18 °С не более 6 месяцев.

Подготовка диагностикума эритроцитарного сальмонеллезного (СЭД)

Для приготовления рабочего разведения суспензии диагностикума эритроцитарного сальмонеллезного к содержимому флакона с сухим 6 % СЭД добавляют 0,6 мл дистиллированной воды и оставляют для гидратации на 2 часа при температуре от 16 до 25 °С. Затем к раствору добавляют 2,4 мл фосфатного буферного раствора (ФБР). Рабочий раствор хранят при температуре от 2 до 8 °С не более 1 мес. Замораживание не допускается.

Постановка РПГА при скрининге сывороток крови

Сыворотки крови для скринингового исследования разводят в лунках планшета следующим образом:

предварительные разведения 1:20 готовят в первых лунках планшета, внося в них сначала 190 мкл раствора РИП, затем - по 10 мкл исследуемых сывороток. Каждую сыворотку вносят отдельным наконечником и тщательно пипетируют (при этом цвет раствора в лунках после добавления сывороток должен измениться с сине-фиолетового на зеленый);
скрининговые разведения 1:40 готовят во вторых лунках, внося в них сначала по 25 мкл раствора ФБР, а затем по 25 мкл предварительно разведенных сывороток и тщательно пипетируют.

При каждой постановке РПГА необходимо проводить контрольное определение титра К+. Для этого в 8 лунок длинного ряда вносят по 50 мкл раствора ФБР. Затем в первую лунку вносят 50 мкл рабочего раствора К+ (1:20), тщательно пипетируют и переносят в следующие лунки по 50 мкл, получая 2-кратные разведения от 1:40 до 1:5120. Еще в 4 лунки вносят по 50 мкл раствора ФБР для контроля СЭД на отсутствие спонтанной гемагглютинации.

Во все лунки планшета со скрининговыми разведениями исследуемых сывороток (кроме первых, содержащих РИП) и контролями вносят по 25 мкл СЭД. Суспензию СЭД во флаконе или ванночке перед использованием перемешать! Планшет тщательно встряхивают и оставляют при температуре от 16 до 25 °С на 30 - 40 минут до полного оседания эритроцитов в контроле.

Постановка РПГА при титровании исследуемых сывороток крови

Титрование исследуемых сывороток и рабочего раствора К+ проводят в коротких рядах планшета. Еще один короткий ряд используют для контроля на отсутствие спонтанной гемагглютинации СЭД.

В первые лунки коротких рядов для титрования исследуемой сыворотки вносят 180 мкл раствора РИП. Во все остальные лунки вносят по 50 мкл раствора ФБР.

В лунки с раствором РИП вносят 20 мкл исследуемых сывороток (получают разведение 1:10). Каждую сыворотку вносят своим наконечником и тщательно пипетируют (цвет раствора в лунках должен измениться с сине-фиолетового на зеленый). Затем из первых лунок переносят по 50 мкл в следующие лунки рядов, получая двукратные разведения от 1:20 до 1:1280. В конце титрования из последних лунок растворы в объеме 50 мкл удаляют.

Для контроля диагностикума на отсутствие спонтанной гемагглютинации во все лунки короткого ряда вносят по 50 мкл раствора ФБР.

Во все лунки (кроме первых лунок каждого ряда для исследуемых сывороток, содержащих РИП) вносят по 25 мкл СЭД. Суспензию СЭД во флаконе или ванночке перед использованием перемешать! Планшет тщательно встряхивают и оставляют при температуре от 16 до 25 °С на 30 — 40 минут до полного оседания эритроцитов в контроле.

Учет и интерпретация результатов

Учет результатов при скрининге сывороток крови

Учет результатов проводят по условной шкале четырех крестов. Титром сыворотки считается ее разведение, дающее гемагглютинацию не менее чем на 3 (+++) креста.

++++ (4+) — агглютинированные эритроциты образуют на дне лунки перевернутый "зонтик", края его опадают;
+++ (3+) — агглютинированные эритроциты образуют на дне лунки перевернутый "зонтик", края его ровные;
++ (2+) — наряду с агглютинированныеми эритроцитами на дне лунки имеется осадок в виде небольшого «кольца» из неагглютинированных эритроцитов;
+ (1+) — большинство эритроцитов не агглютинировано и оседает в виде небольшого «кольца»;
(-) — неагглютинированные эритроциты образуют на дне лунки «точку».

Положительным результатом считают гемагглютинацию нагруженных Vi-антигеном эритроцитов не менее, чем на 3 креста (+++).

Контролем качества диагностикума служат 4 лунки контрольного ряда, в которые вносили только раствор ФБР и СЭД. В этих лунках не должно быть спонтанной гемагглютинации — реакция отрицательная (-). В противном случае следует повторить исследование. Если при повторной постановке появляется гемагглютинация, то препарат не используется.

Сыворотки с отрицательным результатом следует считать не содержащими антител к Vi-антигену в диагностическом титре 1:40 и ниже.

Сыворотки, дающие положительный результат в разведении 1:40, следует исследовать повторно в варианте с титрованием сыворотки для установления ее титра.

Учет результатов при титровании сывороток крови

Титром сыворотки считается ее разведение, дающее гемагглютинацию не менее, чем на 3 (+++) креста.

Контролем качества диагностикума служат лунки ряда для контроля СЭД. В этих лунках не должно быть спонтанной гемагглютинации — реакция отрицательная (-). В противном случае следует повторить исследование. Если при повторной постановке появляется гемагглютинация, то препарат не используется.