61. Реакции с участием комплемента. Реакция связывания комплемента. Механизм, компоненты, способы постановки, применение. Реакция радиального гемолиза

Реакции с участием комплемента

Реакции с участием комплемента основаны на активации комплемента комплексом анти­ген-антитело (реакция связывания компле­мента, радиального гемолиза и др.).

Реакция связывания комплемента (РСК ) за­ключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммун­ный комплекс, к которому через Fc -фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комп­лексом антиген-антитело. Если же комплекс антиген-антитело не образуется, то комп­лемент остается свободным (рис. 13.8). РСК проводят в две фазы: 1-я фаза - инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (инди­каторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемоли­тической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содер­жащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген-антите­ло происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизирован­ных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная. Если антиген и ан­титело не соответствуют друг другу (в иссле­дуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - ан- тиэритроцитарное антитело, вызывая гемо­лиз; реакция отрицательная.

РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифи­лиса (реакция Вассермана).

Эту реакцию применяют для обнаружения антител в сыворотке крови больных при бактериальных, вирусных, протозойных инфекциях, а также для определения и типирования вирусов, выделенных у больных. РСК относится к сложным серологическим реакциям, в которых, кроме антигена, антитела и комплемента, участвует еще и гемолитическая система, выявляющая результаты реакции. РСК протекает в две фазы: первая - взаимодействие антигена с антителом при участии комплемента и вторая - выявление степени связывания комплемента при помощи гемолитической системы. Эта система состоит из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, полученной путем иммунизации лабораторных животных, эритроцитами. Эритроциты обрабатывают - сенсибилизируют, присоединяя к ним сыворотку при температуре 37°С, в течение 30 мин. Лизис сенсибилизированных эритроцитов барана наступает только в случае присоединения к гемолитической системе комплемента. В отсутствие его эритроциты не изменяются. Результаты РСК зависят от наличия в исследуемой сыворотке антител. Если сыворотка содержит антитела, гомологичные антигену, используемому в реакции, то образующийся комплекс антиген - антитело присоединяет, связывает комплемент. При добавлении гемолитической системы в этом случае гемолиза не произойдет, так как весь комплемент расходуется на специфическую связь комплекса антиген - антитело. Эритроциты остаются не измененными, поэтому отсутствие гемолиза в пробирке регистрируют как положительную РСК. При отсутствии в сыворотке антител, соответствующих антигену, специфический комплекс антиген - антитело не образуется и комплемент остается свободным. При добавлении гемолитической системы комплемент присоединяется к ней и вызывает гемодиз эритроцитов. Разрушение эритроцитов, их гемолиз характеризует отрицательную реакцию.

Для постановки РСК необходимы: сыворотка больного, комплемент, гемолитическая система, состоящая из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, а также изотонический раствор хлорида натрия. Реакцию ставят в серологических пробирках. Эритроциты барана получают из дефибринированной крови барана путем троекратного отмывания их изотоническим раствором хлорида натрия. Гемолитическую сыворотку выпускают в готовом виде в ампулах, на этикетке которых указан ее титр, т. е. максимальное разведение сыворотки, которое еще вызывает гемолиз при добавлении к эритроцитам в присутствии комплемента. Гемолитическую сыворотку получают путем иммунизации животных, например кролика эритроцитами барана. При постановке реакции сыворотку используют в тройном титре. Например, титр гемолитической сыворотки 1: 1200, а рабочее разведение 1: 400. В качестве комплемента используют свежую сыворотку крови морской свинки (в течение 24-48 ч) или сухой комплемент в ампулах. Предварительно перед постановкой РСК комплемент разводят 1: 10 и титруют для установления титра - наименьшего количества комплемента, которое дает гемолиз эритроцитов при соединении с гемолитической системой, используемой в данной реакции. Учитывая возможные антикомплементарные свойства антигена, при постановке реакции к установленному рабочему титру комплемента делают 20-30% надбавку.
Антигеном для РСК являются взвеси убитых бактерий, экстракты, приготовленные из этих взвесей, отдельные химические фракции микробов. Основное требование к антигену - отсутствие угнетения активности комплемента. Он не должен обладать антикомплементарными свойствами. Для выявления этих свойств антигена комплемент дополнительно титруют в присутствии используемого в реакции антигена. Существуют определенные схемы постановки РСК. Результаты реакции учитывают по наличию или отсутствию гемолиза эритроцитов в гемолитической системе. РСК применяют при диагностике сифилиса (реакция Вассермана), гонореи (реакция Борде-Жангу), токсоплазмоза, риккетсиозных и вирусных заболеваний.

Реакцию радиального гемолиза (РРГ ) ставят в лунках геля из агара, содержащего эрит­роциты барана и комплемент. После внесе­ния в лунки геля гемолитической сыворотки (антител против эритроцитов барана) вокруг них (в результате радиальной диффузии анти­тел) образуется зона гемолиза. Таким образом можно определить активность комплемента и гемолитической сыворотки, а также антитела в сыворотке крови у больных гриппом, крас­нухой, клещевым энцефалитом. Для этого на эритроцитах адсорбируют соответствующие антигены вируса, а в лунки геля, содержащего данные эритроциты, добавляют сыворотку крови больного. Противовирусные антитела взаимодействуют с вирусными антигенами, адсорбированными на эритроцитах, после че­го к этому комплексу присоединяются ком­поненты комплемента, вызывая гемолиз.

Лабораторная диагностика практически всех инфекционных заболеваний основана на выявлении в крови больного антител, которые вырабатываются на антигены возбудителя, методами серологических реакций. Они вошли во врачебную практику с конца девятнадцатого - начала двадцатого века.

Развитие науки помогло определить антигенную структуру микробов и химические формулы их токсинов. Это позволило создать не только лечебные, но и диагностические сыворотки. Их получают путем введения ослабленных возбудителей лабораторным животным. После нескольких дней выдержки из крови кроликов или мышей готовят препараты, используемые для идентификации микробов или их токсинов, используя серологические реакции.

Внешнее проявление такой реакции зависит от условий ее постановки и от состояния антигенов в крови больного. Если частички микробов нерастворимы, то они осаждаются, лизируются, связываются или иммобилизуются в сыворотке. Если антигены растворимы, то проявляется феномен нейтрализации или преципитации.

Реакция агглютинации (РА)

Серологическая реакция агглютинация является высокоспецифичной. Она проста в исполнении и достаточно наглядна, чтобы быстро определить наличие антигенов в сыворотке крови больного. Ее используют для постановки реакции Видаля (диагностика брюшного тифа и паратифа) и Вейгля (сыпной тиф).

Она основана на специфическом взаимодействии между антителами человека (или агглютининами) и микробными клетками (агглютеногенами). После их взаимодействия образуются частицы, которые выпадают в осадок. Это и есть положительный признак. Для постановки реакции могут использоваться живые или убитые микробные агенты, грибы, простейшие, и соматические клетки.

Химически реакция разбита на два этапа:

1. Специфическое соединение антител (АТ) с антигенами (АГ).
2. Неспецифическая - осаждение конгломератов АГ-АТ, то есть образование агглютината.

Реакция непрямой агглютинации (РПГА)

Для ее постановки используют очищенные бараньи эритроциты и красные кровяные тельца человека, предварительно обработанные антителами или антигенами (это зависит от того, что именно лаборант хочет найти). В некоторых случаях человеческие эритроциты обрабатывают иммуноглобулинами. Серологические реакции эритроцитов считаются состоявшимися, если произошло их осаждение на дно пробирки. О положительной реакции можно говорить, когда клетки располагаются в виде перевернутого зонтика, занимая все дно. Отрицательная реакция засчитывается, если эритроциты осели столбиком или в виде пуговки в центре дна.

Реакция преципитации (РП)

Серологические реакции этого типа служат для выявления крайне малых частиц антигенов. Это могут быть, например, белки (или их части), соединения белков с липидами или углеводами, части бактерий, их токсины.

Сыворотки для проведения реакции получают путем искусственного заражения животных, обычно кроликов. Таким методом можно получит абсолютно любую преципитирующую сыворотку. Постановка серологических реакций преципитации похожа по механизму действия на реакции агглютинации. Антитела, содержащиеся в сыворотке, соединяются с антигенами в образуя крупные белковые молекулы, которые осаждаются на дно пробирки или на субстрат (гель). Этот способ считается высокоспецифичным и может обнаружить даже ничтожно малые количества вещества.

Используется для диагностики чумы, туляремии, сибирской язвы, менингита и других заболеваний. Кроме того, задействован в судебно-медицинской экспертизе.

в геле

Серологические реакции можно проводить не только в жидкой среде, но и в агаровом геле. Это называется метод диффузной преципитации. С его помощью изучают состав сложных антигенных смесей. Этот способ основан на хемотаксисе антигенов к антителам и наоборот. В геле они движутся навстречу друг другу с разной скоростью и, встречаясь, образуют линии преципитации. Каждая линия - один комплект АГ-АТ.

Реакция нейтрализации экзотоксина антитоксином (РН)

Антитоксические сыворотки способны нейтрализовать действие экзотоксина, который вырабатывают микроорганизмы. На этом и основаны данные серологические реакции. Микробиология использует этот способ для титрования сывороток, токсинов и анатоксинов, а также определения их лечебной активности. Сила нейтрализации токсина определяется условными единицами - АЕ.

Кроме того, благодаря этой реакции можно определить видовую или типовую принадлежность экзотоксина. Это применяется при дифтерии, ботулизма. Исследование можно проводить как «на стекле», так и в геле.

Реакция лизиса (РЛ)

Иммунная сыворотка, которая попадает в организм больного, обладает, кроме своей основной функции пассивного иммунитета, еще и лизирующими свойствами. Она способна растворять микробные агенты, клеточные чужеродные элементы и вирусы, поступающие в организм больного. В зависимости от специфичности входящих в состав сыворотки антител выделяют бактериолизины, цитолизины, спирохетолизины, гемолизины и другие.

Эти специфические антитела называются "комплемент". Он содержится практически во всех жидкостях тела человека, имеет сложную белковую структуру и крайне чувствителен к повышению температуры, встряхиванию, действию кислот и прямых солнечных лучей. Но в высушенном состоянии способен сохранять свои лизирующие свойства до полугода.

Существуют такие виды серологических реакций этого типа:

Бактериолиз;

Гемолиз.

Бактериолиз проводят, используя сыворотку крови пациента и специфическую иммунную сыворотку с живыми микробами. Если в крови присутствует достаточное количество комплемента, то исследователь увидит лизис бактерий, и реакция будет считаться положительной.

Вторая серологическая реакция крови заключается в том, что взвесь эритроцитов больного обрабатывают сывороткой, содержащей гемолизины, которые активизируются только в присутствии определенного комплимента. Если таковой имеется, то лаборант наблюдает растворение красных клеток крови. Данная реакция широко используется в современной медицине для определения титра комплемента (то есть его наименьшего количества, провоцирующего лизис эритроцитов) в сыворотке крови и для постановки анализа на связывание комплемента. Именно этим способом проводится серологическая реакция на сифилис -

Реакция связывания комплемента (РСК)

Эта реакция используется для того, чтобы обнаружить в сыворотке крови больного антитела к инфекционному агенту, а также с целью идентифицировать возбудителя по его антигенной структуре.

До этого момента мы описывали простые серологические реакции. РСК считается сложной реакцией, так как в ней взаимодействуют не два, а три элемента: антитело, антиген и комплемент. Суть ее заключается в том, что взаимодействие между антителом и антигеном происходит только в присутствии белков комплимента, которые адсорбируются на поверхности образовавшегося комплекса АГ-АТ.

Сами антигены, после присоединения комплемента, подвергаются существенным изменениям, которые и показывают качество проведенной реакции. Это может быть лизис, гемолиз, иммобилизация, бактерицидное или бактериостатическое действие.

Сама реакция происходит в две фазы:

1. Образование комплекса антиген-антитело, которое визуально не заметно исследователю.
2. Изменение антигена под действием комплемента. Эта фазу чаще всего можно отследить невооруженным глазом. Если же визуально реакции не видно, то используют дополнительную индикаторную систему, позволяющую выявить изменения.

Индикаторная система

Данная реакция основана на связывании комплемента. В исследуемую пробирку спустя час после постановки РСК добавляют очищенные эритроциты барана и гемолитическую сыворотку, не содержащую комплемента. Если в пробирке остался несвязанный комплемент, то он присоединится к комплексу АГ-АТ, образованному между бараньими клетками крови и гемолизином, и вызовет их растворение. Это будет означать, что РСК отрицательна. Если эритроциты остались целыми, то, соответственно, реакция положительная.

Реакция гемагглютинации (РГА)

Существуют две принципиально разные реакции гемагглютинации. Одна из них - серологическая, она используется для определения групп крови. В этом случае эритроциты взаимодействуют с антителами.

А вторая реакция не относится к серологическим, так как красные кровяные тельца реагируют с гемагглютининами, продуцируемыми вирусами. Так как каждый возбудитель действует только на конкретные эритроциты (куриные, бараньи, обезьяньи), то можно считать эту реакцию узкоспецифичной.

Понять, положительная реакция или отрицательная, можно по расположению клеток крови на дне пробирки. Если их рисунок напоминает перевернутый зонтик, значит, искомый вирус присутствует в крови больного. А если все эритроциты сложились наподобие монетного столбика, то искомых возбудителей нет.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Это высокоспецифичная реакция, позволяющая установить вид, тип вирусов или наличие специфических антител в сыворотке крови пациента.

Суть ее заключается в том, что антитела, добавленные в пробирку с исследуемым материалом, препятствую осаждению антигенов на эритроцитах, тем самым останавливая гемагглютинацию. Это и является качественным признаком наличия в крови специфических антигенов к конкретному искомому вирусу.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

В основе реакции лежит способность выявлять комплексы АГ-АТ при после их обработки флюорохромными красителями. Это метод прост в обращении, не требует выделения чистой культуры и занимает мало времени. Он незаменим для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний.

В практике эти серологические реакции делятся на два вида: прямые и непрямые.

Прямая РИФ производится с антигеном, который заранее обработан флюоресцирующей сывороткой. А непрямая заключается в том, что сначала препарат обрабатывают обычным диагностикумом, содержащим антигены к искомым антителам, а затем повторно наносится люминесцентная сыворотка, которая специфична к белкам комплекса АГ-АТ, и микробные клетки становятся заметны при микроскопии.

Реакция связывания комплемента заключается в том, что соединение антигена с соответствующим ему антителом извлекает из свежей сыворотки и прочно удерживает (связывает) находящийся в ней комплемент. Применяется для обнаружения антител и определения природы антигенов. При отсутствии специфического сродства между антигеном и сывороткой адсорбция комплемента не происходит.
Для проведения этой реакции необходимы следующие ингредиенты:
- 3 или 5%-ная взвесь эритроцитов барана;
- гемолитическая сыворотка в дозе, соответствующей ее утроенному титру;
- комплемент в дозе, установленной титрованием; антиген, не вызывающий самостоятельно ни гемолиза, ни его задержки, в дозе, установленной титрованием;
- испытуемая сыворотка, активированная при 56°С в течение 15–30 мин в водяной бане и разведенная 1: 5 или 1: 10; стерильный физиологический раствор (0,85%).
Эритроциты барана. Эритроциты барана получают накануне постановки реакции пункцией яремной вены у барана в асептических условиях при помощи канюли. Кровь собирают в стерильную банку, содержащую стеклянные бусы, которые встряхивают для дефибринирования в течение 10–15 мин. После этого кровь фильтруют через несколько слоев марли и производят трехкратное отмывание эритроцитов в физиологическом растворе на центрифуге. Последняя порция промывной жидкости должна быть бесцветной.
Для постановки реакции применяется 1–3%-ная взвесь эритроцитов, которая готовится из 1 мл осадка отмытых эритроцитов + 33 мл физиологического раствора. В холодильнике эритроциты могут сохраняться пять-шесть дней. Для более длительного хранения их отмывают в жидкости Рингер-Локка следующего состава: NaCl – 9,0 г, КСl – 0,2 г, СаСl2 – 0,2 г, NaHСО3 – 1,0 г на 1 л дистиллированной воды. Жидкость стерилизуют паром в течение 30 мин, а затем добавляют 10 г кристаллической борной кислоты. На леднике эта жидкость может храниться две-три недели.
Консервировать эритроциты можно также и формалином, добавляя к 10 мл осадка эритроцитов 1 мл раствора формалина такого состава: 4 мл 40%-ного формалина на 200 мл физиологического раствора.
Гемолитическая сыворотка. Для получения гемолитической сыворотки кроликам внутривенно вводят три-четыре раза 50%-ную взвесь бараньих эритроцитов по 2–5 млн. с интервалами в два-три дня. На шестой-седьмой день после окончания иммунизации проверяют титр сыворотки. Если он не ниже 1: 1200, у животного берут кровь из сердца или из краевой вены уха. После инактивации на водяной бане при 55° С в течение 30 мин сыворотку консервируют с добавлением к ней 1 % сухой борной кислоты. Для консервирования сыворотки можно применять равный объем стерильного глицерина, прогретого при 180° С в течение 15 мин или добавлять 1 мл смеси на 9 мл сыворотки такого состава – карболовой кислоты 5,5 мл + глицерина 20 мл +74,5 мл дистиллированной воды. Можно использовать также 0,05%-ный хинозол. Сыворотку надо хранить в запаянных пробирках на леднике.
Титр гемолитической сыворотки определяется по следующей схеме.

В ряд пробирок последовательно отмеряют по 0,5 мл полученных разведений, начиная с 1: 1000. Затем в каждую пробирку добавляют по 0,5 мл 3%-ной взвеси эритроцитов, 0,5 мл разведенного 1: 10 комплемента и 1 мл физиологического раствора. Отмеривать разведения сыворотки надо градуированной пипеткой, начиная с последней пробирки, содержащей минимальное разведение сыворотки, чтобы не нарушить точности разведений.
Ниже приводим схему титрования гемолитической сыворотки.

Титром гемолитической сыворотки называется ее максимальное разведение, 0,5 мл которого может растворить 0,5 мл взвеси эритроцитов при наличии 0,5 мл (разведенного) комплемента в течение 1 час при соответствующей температуре.
Гемолитическую сыворотку (гемолизин, гемолитический амбоцептор по Эрлиху) можно приобрести в соответствующих снабжающих организациях. Она отпускается в ампулах, содержащих 1–2 мл и бывает годной к употреблению в течение шести месяцев. На ампулах указан титр, т. е. предельное разведение сыворотки, которая, будучи смешана с равным объемом (по 0,5 мл) 10%-ного комплемента, полностью гемолизирует 0,5 мл взвеси бараньих эритроцитов после 1-часового стояния в термостате. Титр сыворотки время от времени необходимо проверять. Для постановки основного опыта, а также для титрования антигена и комплемента применяют разведение, которое в три раза меньше титра. Например, если титр равен 1: 1200, берут разведение 1: 400 (0,1 мл гемолитической сыворотки + 40 мл физиологического раствора).
После вскрытия ампулы оставшуюся сыворотку переливают в сухую стерильную пробирку и хранят на холоду.
Комплемент. Комплементарная функция выражена наиболее интенсивно в сыворотках млекопитающих животных и особенно в сыворотке морской свинки. Вот почему в качестве комплемента и применяется активная сыворотка морских свинок.
Сыворотку получают при помощи пункции сердца у трехпяти здоровых небеременных и не подвергавшихся обработке человеческим белком морских свинок, смешивая отдельные порции вместе. После образования сгустка фибрина последний отделяют от стенок пробирки, которую помещают в ледник. На следующий день отсасывают прозрачную сыворотку, которая называется комплементом. Для реакции необходимо употреблять только тот комплемент, который получен накануне, так как активность его сохраняется на леднике один-два дня. Комплемент можно консервировать добавлением 4%-ной борной кислоты и 5%-ного сернокислого натрия в сухом виде. После растворения указанных веществ комплемент помещают на ледник. Перед каждым выполнением опыта производится титрование комплемента для определения так называемой рабочей дозы. Приготовляют при помощи градуированной пипетки основное разведение комплемента 1: 10 (1 мл комплемента + 9 мл физиологического раствора), которое разливают в ряд пробирок от 0,05 до 0,5 мл, после чего доводят объем каждой пробирки физиологическим раствором до 1,5 мл, помещая их затем в термостат. Через 15 мин к 3%-ной взвеси бараньих эритроцитов прибавляют равный объем гемолизина, взятого в тройном титре. После трехкратного переливания из одного сосуда в другой полученную смесь выдерживают еще 30 мин в термостате. После этого во все пробирки с разведениями комплемента добавляют по 1 мл гемолитической смеси, тщательно встряхивают и снова помещают в термостат на 30 мин. В качестве двух контролей применяют: 1 мл гемолитической системы + 1,5 мл физиологического раствора и 0,5 мл комплемента, разведенного 1: 10 + + 0,5 мл взвеси эритроцитов +1,5 мл физиологического раствора.
Титром комплемента называется то минимальное его количество, при наличии которого 0,5 мл гемолитической сыворотки в тройном титре способно лизировать 0,5 мл 3%-ной взвеси эритроцитов в течение 30 мин при 37° С.

В связи с антагонистическим влиянием на комплемент других ингредиентов (антиген, гемолитическая сыворотка), участвующих в реакции, практически дозу комплемента надо увеличить на 20–35%, представляющую собой так называемую рабочую дозу. Так, при титре 0,25 рабочая доза будет составлять 0,3–0,33. Однако, при употреблении антигенов с заведомо антикомплементарной способностью необходимо определить рабочую дозу комплемента при наличии антигена по следующей схеме.

Если же антиген не обладает антикомплементарными свойствами, то рабочая доза комплемента остается той, которая была определена титрованием комплемента per se.
Пункции сердца у одной и той же свинки можно повторять много раз с промежутками три-четыре недели.
Антиген. Антиген готовят из бактериальной культуры. Наиболее простым антигеном является взвесь в дистиллированной воде или физиологическом растворе микробов, убитых нагреванием при 60° С в течение 1 час или при 100° С в течение 15– 20 мин.
В качестве антигена может применяться также микробная взвесь, убитая парами формалина или обработанная алкоголем. Для получения антигена, обработанного алкоголем, поступают таким образом: взвесь 24-часовой агаровой культуры, предварительно промытую физиологическим раствором, центрифугируют. Жидкость декантируют, а осадок заливают 95°-ным спиртом в соотношении 1: 5, после чего оставляют на два-три дня при комнатной температуре. После удаления алкоголя осадок микробов заливают физиологическим раствором и консервируют добавлением 1%-ной сухой борной кислоты. Для реакции исходную взвесь разводят по оптическому стандарту, содержащему 1 млрд. бактериальных тел в 1 мл, употребляя ее в количестве 0,5 мл в качестве антигена.
Микробные лизаты в дистиллированной воде или физиологическом растворе, полученные в шюттель-аппарате или после обработки антиформином, также могут служить антигеном.
Для получения антигена при обработке культуры антиформином необходимо к суточной агаровой культуре бактерий, смытой 1,5 мл физиологического раствора, добавить 2 мл 3–4%-ного антиформина, нейтрализованного по лакмусу с добавлением 4%-ной H2SO4. Хлор удаляют нагреванием лизата на водяной бане при 55–65° С в течение 30 мин под контролем йод-крахмальной бумажки, приобретающей под влиянием хлора чернофиолетовое окрашивание.
Диализированный бактериальный полисахарид, а также полный антиген, полученный по методу Буавена, обладают высокими антигенными качествами.
У антигенов, полученных различными методами, определяют титр, а также антагонистические свойства в отношении активности комплемента (антикомплементарность) и гемотоксичность – способности вызывать лизис эритроцитов в отсутствии сыворотки и комплемента.
Титром антигена называют его количество в 1 мл при общем: объеме реакции в 2,5 мл, при которой происходит отчетливый гемолиз. Антиген берут в количестве 0,5 мл. Для определения рабочей дозы в ряд пробирок отмеривают антиген в количестве от 0,1; 0,2 и т.д. до 0,5 мл, к которым добавляют физиологический раствор до 1 мл. Затем прибавляют по 0,5 мл разведения комплемента, содержащего рабочую дозу и 0,5 мл физиологического раствора, встряхивают и помещают на 1 час в термостат. После этого вынимают из термостата и отмечают пробирку с максимальным содержанием антигена, в которой наблюдается еще гемолиз. Количество антигена в этой пробирке является показателем растворяющей дозы антигена. Ориентировочная доза антигена, необходимая для дальнейшего испытания, составляет 1/2 или 2/3 растворяющей дозы. Для определения специфичности ее испытывают затем с заведомо положительными и отрицательными сыворотками. При успешном титровании антигена такого рода найденную дозу принимают за его титр, которым и пользуются для постановки реакции. Схема определения ориентировочной дозы антигена следующая.

Антикомплементарность устанавливают путем параллельных фильтрований комплемента per se при наличии антигена, который не должен подавлять активность комплемента больше чем на 30%, в противном случае он не годится для реакции.
Для определения гемотоксичности к 1 мл антигена, разведенного по титру, добавляют 0,5 мл 3%-ной взвеси эритроцитов и 1 мл физиологического раствора и помещают на 1 час в термостат. Отсутствие гемолиза указывает на отсутствие гемотоксических свойств антигена. Следует отметить, что все антигены бактериального происхождения (взвеси, лизаты, экстракты) перед опытом обязательно подвергаются титрованию, за исключением бактериального алкогольного антигена, который вообще способен долгое время сохранять свой титр. Кроме того, бактериальная взвесь определенной концентрации (например, 1 млрд. клеток в 1 мл по оптическому стандарту) также исключает необходимость титрования, так как 0,5 мл такой взвеси лишена антикомплементарных и гемотоксических свойств. Сохранять антигены следует на леднике.
Сыворотки. Для определения неизвестного антигена применяется специфическая иммунная сыворотка, полученная путем иммунизации кроликов и обладающая большей частью высоким титром. Полученная сыворотка инактивируется в водяной бане при 55–56° С в течение 30 мин. Инактивирование проводится с целью стабилизации коллоидов сыворотки. Такая сыворотка может сохраняться в леднике пять-шесть дней. Срок хранения ее увеличивается до двух-трех недель, если к инактивированной сыворотке добавить 2% сухой борной кислоты или смеси из 4% сухой борной кислоты и 5% кристаллического сернокислого натрия. Сыворотки хранят в запаянных ампулах.
Проведение реакции. При постановке реакции сначала смешивают исследуемую сыворотку, антиген и комплемент таким образом, чтобы количество каждого ингредиента равнялось 0,5 мл. После тщательного встряхивания каждой пробирки штатив помещают в термостат на 1 час при 37° С. Через 30 мин после этого готовят гемолитическую систему, т. е. смешивают в равных объемах 3%-ную взвесь эритроцитов барана с разведенной по утроенному титру гемолитической сывороткой. Смесь помещают на 30 мин в термостат. По истечении указанного срока во все пробирки добавляют по 1 мл гемолитической системы, тщательно перемешивают и помещают в термостат на 40–60– 120 мин в зависимости от времени появления гемолиза в контрольных пробирках, не содержащих антигена. Затем производится первое определение результатов опыта, после чего штатив помещают в ледник на 12–18 час или оставляют при комнатной температуре. По истечении этого срока учитывают окончательные результаты опыта.
При наличии полного гемолиза (лаковая кровь) во всех четырех пробирках, взятых для исследования сыворотки, результат считается отрицательным. При положительных результатах в первых трех пробирках наблюдается задержка гемолиза, а в четвертой (контроль сыворотки), не содержащей антигена, – полный гемолиз. Степень задержки гемолиза принято обозначать количеством крестов.
(++++) – полная задержка гемолиза (жидкость бесцветна, значительный осадок неизмененных эритроцитов);
(+++) – ясная задержка (жидкость слабо-розового цвета, значительный осадок эритроцитов);
(++) – частичная задержка (жидкость интенсивно окрашена, довольно компактный осадок эритроцитов);
(+) – слабая задержка (жидкость интенсивно окрашена, незначительный осадок эритроцитов);
(±) – следы задержки (жидкость интенсивно окрашена, осадок в виде облачка);
(–) – полный гемолиз (жидкость интенсивно окрашена, отсутствие осадка, отрицательная реакция).
Приводим схему основного опыта.

Реакцию связывания комплемента (РСК) используют для выявления антител на определенный антиген или определяют тип антигена по известному антителу. Это сложная серологическая реакция, в ней участвуют две системы и комплемент. Первая система – бактериологическая (основная), состоит из антигена и антитела (один известный, другой нет). Вторая система – гемолитическая (индикаторная). В нее входят эритроциты барана (антиген) и соответствующая им гемолитическая сыворотка (антитело). РСК ставят в два приема: вначале соединяют антиген с испытуемой сывороткой крови, в которой отыскивают антитело, а затем добавляют комплемент. Если антиген и антитело соответствуют друг другу, то образуется иммунный комплекс, который связывает комплемент. При отсутствии в сыворотке антител иммунный комплекс не образуется и комплемент остается свободным. Поскольку процесс адсорбции комплемента комплексом визуально невидимый, то для выявления этого процесса добавляют гемсистему. Реакцию учитывают следующим образом. Если в первой (баксистеме) комплемент связался, то при добавлении гемсистемы гемолиз эритроцитов не произойдет – реакция положительная. Если же комплемент не связался в первой системе из-за отсутствия антител, то он свяжется с гемсистемой, в результате чего произойдет гемолиз эритроцитов – реакция отрицательная.

Антигены для РСК готовят из убитых и разрушенных микробов, чаще путем экстрагирования.

РСК широко используют для диагностики бруцеллеза, сапа, риккетсиозов, ящура и многих других.

Реакция длительного связывания комплемента (РДСК). Это вариант обычной РСК, но отличающийся тем, что первая фаза реакции протекает в течение 16–18 ч на холоде (4°С). В таких условиях в первой системе в комплексе антиген – антитело – комплемент дополнительно связываются и криофильные (холодовые) антитела, что повышает чувствительность реакции. Этот вариант используют для диагностики бруцеллеза, кампилобактериоза и др.

Реакция связывания комплемента (РСК) впервые описана Борде и Жангу (1901). В отличие от РА и РП при РСК соединение антигена с антителом проявляется только в присутствии третьего компонента – комплемента.

Реакция образования комплекса, Антиген – антите Ло – комплемент – невидимая. Чтобы выявить указанное взаимодействие компонентов реакции, используют дополнительную индикаторную систему, которая по своей наглядности проявления косвенно отражает результат взаимодействия в первой системе. Таким образом; в РСК участвуют две системы: 1) бактериолитическая (диагностическая) и 2) гемолитическая (вспомогательно-индикаторная), которая позволяет установить, произошло ли связывание комплемента в первой системе. Ранее в качестве, антигена использовали взвесь бактерий, и в положительных случаях происходил их лизис (бактериолиз), поэтому первая система получила название бактериолитической. Следовательно, в основу РСК легли два явления – бактериолиз и гемолиз.

РСК осуществляют в два этапа. Сначала готовят бактериолитическую систему – в пробирках смешивают по 0,5 мл исследуемую инактивированную сыворотку с антигеном, добавляют комплемент в строго определенном количестве (титре). Смесь антиген – антитело (сыворотка) – комплемент (бактериолитическая система) помещают в водяную баню (или термостат) при 37–38 °С на 20–40 мин. Далее приступают ко второму этапу реакции – во все пробирки добавляют компоненты второй гемолитической системы и вновь ставят в водяную баню на 15–20 мин. Затем учитывают предварительный результат (есть или нет гемолиза), оставляют при комнатной температуре до следующего дня и производят окончательный учет РСК. Отсутствие гемолиза (положительный диагностический результат) свидетельствует, что в испытуемой сыворотке имеются антитела, специфичные взятому антигену, комплекс антиген – антитело в первой системе образовался, комплемент связался. Добавляют компоненты второй системы – гемолизин и эритроциты, которые один по отношению к другому тоже являются антигеном (эритроциты) и антителом (гемолизин) и взаимодействуют в присутствии комплемента. Если же в исследуемой сыворотке нет антител, специфичных к взятому антигену, комплекс антиген – антитело не образуется и комплемент в первой бактериолитической системе не адсорбируется, остается в пробирке свободным, то при добавлении второй (гемолитической) системы комплемент взаимодействует с комплексом антиген – антитело (гемолизин – эритроциты) и происходит гемолиз (лизис эритроцитов). Диагностический результат отрицательный. Таким образом, в РСК участвуют 5 компонентов: антиген, антитело (исследуемая сыворотка), комплемент, гемолизин, взвесь эритроцитов барана. Для разведения всех компонентов используется электролитная среда–физраствор NaС1.

Для постановки РСК в диагностической лаборатории необходимо следующее: пробы сывороток от животных, поступившие в лабораторию для исследования; две сыворотки заведомо позитивные (стандартные, гипериммунные, обеспечивающие положительный результат – для контроля) и две нормальные сыворотки от здоровых животных – также для контроля (все сыворотки в разведении 1: 10 инактивируют для разрушения их собственного комплемента нагреванием в водяной бане при 56–58 °С 30 мин); антиген в разведении согласно титру (указанному биофабрикой на упаковке); комплемент (сыворотка морской свинки) в разведении соответственно установленному титру (при титрации); гемолизин в рабочем титре; взвесь эритроцитов барана в разведении 1: 40, физиологический раствор, градуированные пипетки различной емкости, пробирки, штативы, водяная баня, резиновые груши.

РСК широко используют для лабораторной диагностики венерических болезней, риккетсиозов, вирусных инфекций. Реакция протекает в две фазы. Первая фаза - взаимодействие антигена и антител при обязательном участии комплемента. Вторая - выявление результатов реакции при помощи индикаторной гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка). Разрушение эритроцитов гемолитической сывороткой происходит только в случае присоединения комплемента к гемолитической системе. Если же комплемент адсорбировался ранее на комплексе антиген-антитело, то гемолиз эритроцитов не наступает. При наличии в исследуемой сыворотке антител , комплементарных антигену, образующийся комплекс антиген-антитело связывает (адсорбирует) на себе комплемент. При добавлении гемолитической системы гемолиза не происходит (задержка гемолиза ) , т.к. весь комплемент израсходован на специфическую связь комплекса антиген-антитело, а эритроциты остались неизменными. При отсутствии в сыворотке антител , комплементарных антигену, специфический комплекс антиген-антитело не образуется и комплемент остается не связанным. Поэтому при добавлении гемолитической системы комплемент присоединяется к ней. Результатом реакции в данном случае будет гемолиз эритроцитов - в пробирках образуется так называемая «лаковая» кровь.

Рис. 6. Схема РСК: а - индикаторная система (эритроциты барана и антитела к ним) в присутствии комплемента определяется в виде гемолиза; б - с сывороткой больного диагностикум (Аг) образует иммунные комплексы и активирует комплемент, результат - задержка гемолиза; в - в сыворотке здорового человека антител нет, комплемент активируется индикаторной системой, результат - гемолиз.

Реакции с применением меченных ат и аг

Реакции с использованием меченных антител и антигенов составляют основу методов экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, так как выявляют минимальное содержание Аг и Ат в исследуемых образцах. В качестве меток могут быть использованы различные ферменты, красители флюорохромы и изотопы.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) Данный метод является экспрессным и высокочувствительным. Существуют две его разновидности. При прямом методе к исследуемой взвеси микробов, фиксированной на стекле, добавляют сыворотку, меченную флуорохромом. Образующийся комплекс антиген-антитело при освещении ультрафиолетовыми (сине-фиолетовыми) лучами дает ярко-зеленое свечение . При непрямом РИФ используют обычные диагностические сыворотки против какого-либо вида микробов. Добавление этой сыворотки к испытуемой взвеси микробов вызывает образование комплекса антиген-антитело. Этот комплекс выявляется с помощью универсальной флюоресцирующей сыворотки, содержащей антитела к гаммаглобулиновой фракции крови того вида животного, от которого была получена диагностическая сыворотка. Светящийся комплекс выявляют при люминесцентной микроскопии.

Рис. 7. Реакция иммунофлюоресценции (схема).

Иммуноферментный анализ (ИФА) В основе иммуноферментного анализа лежит известная иммунная реакция антигена и антитела. Один из этих реагентов является определяемым веществом, а другой - узнающим, обладающим известной стандартной специфичностью (избирательностью) по отношению к определяемому веществу. Для выявления образовавшихся иммунных комплексов (антиген-антитело) используется фермент , которым предварительно метится узнающий компонент (антиген или антитело). Сам фермент, естественно, не виден, поэтому визуализация присутствия вещества, определяемого методом ИФА, достигается применением посредника - хромогена . Это особое химическое соединение, которое хорошо растворимо в воде, и раствор которого бесцветен. Превращение бесцветного хромогена в цветное вещество хромофор происходит под действием фермента, для которого хромоген является субстратом.

Рис. 8. Иммуноферментный анализ (схема).

Аутоантигены - вещества, обладающие способностью вызывать иммунные реакции в организме, из которого они получены. Их содержат мозг, хрусталик глаза, сперматозоиды, паращитовидные железы, гомогенаты семенной железы, кожи, почек, печени и других тканей. Так как в обычных условиях аутоантигены не приходят в соприкосновение с иммунными системами организма, антитела к подобным клеткам и тканям не образуются. Однако при повреждении этих тканей аутоантигены могут всасываться и вызывать образование антител, оказывающих повреждающее действие на соот­ветствующие клетки. Аутоантигены могут возникать также из клеток некоторых органов и тканей под влиянием охлаждения, медикаментозного воздействия, вирусных инфекций, бактериальных бел­ков и токсинов, например стрептококков, стафилококков, микобактерии туберкулеза, и других факто­ров. Они образуются в этом случае вследствие нарушения видовой специфичности собственных антигенов организма.

Антитела, будучи сложными гликопротеидными молекулами, сами по себе также являются антигенами. В их составе различают три типа антигенных детерминантов (элитипов): изотипы, аллотипы и идиотипы.

Изотипы - детерминанты, по которым различаются классы и подклассы тяжелых цепей и вариан­ты каппа- и лямбда- легких цепей.

Аллотипы - детерминанты, кодируемые аллелями данного иммуноглобулинового гена.

Идиотипы - антигенные детерминанты, образуемые активными центрами молекул антител.

На долю класса IgG приходится около 75% общего количества всех иммуноглобулинов сыворотки крови человека.