В зависимости от техники приготовления культуры клеток классифицируют на:

- однослойные – клетки способны прикрепляться и размножаться на поверхности химически нейтрального стекла или пластика.

- суспензионные – клетки размножаются во всем объеме питательной среды при ее перемешивании.

- органные - цельные кусочки органов и тканей, сохраняющие исходную структуру вне организма (применение ограничено).

Наибольшее распространение имеют однослойные культуры клеток, которые можно разделить в зависимости от числа жизнеспособных генераций на

1) первичные (первично трипсинизированные),

2) полуперевиваемые (диплоидные)

3) перевиваемые.

По происхождению они классифицируются на эмбриональные, опухолевые и из взрослых организмов.

По морфогенезу - на фибробластные, эпителиальные и др.

Первичные культуры клеток - это клетки какой-либо ткани человека или животного, которые имеют способность расти в виде монослоя на пластмассовой или стеклянной поверхности, покрытой специальной питательной средой. Срок жизни таких культур ограничен. В каждом конкретном случае их получают из ткани после механического измельчения, обработки протеолитическими ферментами и стандартизации количества клеток. Первичные культуры, полученные из почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека, куриных эмбрионов, широко используются для выделения и накопления вирусов, а также для производства вирусных вакцин.

Полуперевиваемые (или диплоидные ) культуры клеток - клетки одного типа, способные in vitro выдерживать до 50-100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные штаммы фибробластов эмбриона человека используются как для диагностики вирусных инфекций, так и при производстве вирусных вакцин. Чаще всего используют культуры фибробластов эмбриона человека (WI-38, MRC-5, IMR-9), коров, свиней, овец и т.д.

Перевиваемые клеточные линии характеризуются потенциальным бессмертием и гетероплоидным кариотипом. Источником перевиваемых линий могут быть первичные клеточные культуры (например, СОЦ – сердце обезьяны цинамобус, ПЭС – почки эмбриона свиньи, ВНК-21 - из почек однодневных сирийских хомяков; ПМС - из почки морской свинки, Vero – почка зеленой обезьяны и др.) отдельные клетки которых обнаруживают тенденцию к бесконечному размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению из клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур - трансформированными. Другим источником перевиваемых клеточных линий являются злокачественные новообразования . В этом случае трансформация клеток происходит in vivo. Наиболее часто в вирусологической практике применяются такие линии перевиваемых клеток: HeLa - получена из карциномы шейки матки; Нер-2 - из карциномы гортани; Детройт-6 - из метастаза рака лёгкого в костный мозг; RH - из почки человека, КВ – карцинома ротовой полости, RD – рабдомиосаркома человека.

Культуры органов – представляют собой приготовленные в стерильных условиях срезы органов животных, которые на протяжении определенного срока (дни, недели) сохраняют свою жизнедеятельность в особенных условиях культивирования

Наибольшее распространение имеют однослойные культуры клеток, которые можно разделить на первичные (первично трипсинизированные), полуперевиваемые (диплоидные), перевиваемые, трансфецированные.

По происхождению они подразделяются на эмбриональные, опухолевые и из взрослых организмов; по морфогенезу - на фибробластные, эпителиальные и др.

Первичные культуры клеток - это клетки какой-либо ткани человека или животного, способные культивироваться в виде монослоя на пластмассовой или стеклянной поверхности в специальной питательной среде, но не способные к длительному размножению. Срок жизни таких культур ограничен. В каждом конкретном случае их получают из ткани после механического измельчения, обработки протеолитическими ферментами и стандартизации количества клеток. Первичные культуры, полученные из почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека, куриных эмбрионов, широко используются для выделения и накопления вирусов, а также для производства вирусных вакцин.

Полуперевиваемые (диплоидные ) культуры клеток - клетки одного генотипа, способные in vitro выдерживать до 50-100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные линии фибробластов эмбриона человека используются как для диагностики вирусных инфекций, так и при производстве вирусных вакцин.

Перевиваемые клеточные линии характеризуются бессмертием и гетероплоидным кариотипом. Источником перевиваемых линий могут быть первичные клеточные культуры (например, СОЦ - из сердца обезьяны циномольгус, ПЭС - из почек эмбриона свиньи, ВНК-21 - из почек однодневных сирийских хомяков; ПМС - из почки морской свинки и др.), отдельные клетки которых обнаруживают тенденцию к бесконечному размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению в клетках таких свойств, называют трансформацией , а клетки перевиваемых тканевых культур - трансформированными .

Другой источник перевиваемых клеточных линий - злокачественные новообразования . В этом случае трансформация клеток происходит in vivo. Получены и наиболее широко в вирусологической практике применяются следующие линии перевиваемых клеток: HeLa - получена из карциномы шейки матки; Hep-2 - из карциномы гортани; Детройт-6 - из метастаза рака легкого в костный мозг; RH - из опухоли почки человека.

Трансфецированные культуры клеток. Разработаны экспериментальные линии культур клеток методом трансфекции (переноса) генов вирусов, контролирующих биосинтез поверхностных антигенов. Такие культуры клеток экспрессируют поверхностный белок определенного вируса (HBs-антиген, gp120 и др.) на мембране клеток культуры. Такие культуры клеток используются с целью изучения иммунологических механизмов патогенеза вирусных инфекций, разработки химиотерапевтических и иммунобиологических препаратов.

Для обеспечения жизнедеятельности культивируемых клеток необходимы питательные среды . По назначению они делятся на ростовые и поддерживающие. В ростовых питательных средах должно содержаться больше питательных веществ, обеспечивающих активное размножение клеток и формирование монослоя. Поддерживающие среды обеспечивают переживание клеток в уже сформированном монослое в период размножения в них вирусов.

Широкое применение находят стандартные синтетические среды, например, синтетическая среда 199 и среда Игла. Независимо от назначения все питательные среды для культур клеток конструируются на основе сбалансированного солевого раствора. Чаще всего им является раствор Хенкса. Неотъемлемый компонент большинства ростовых сред - сыворотка крови животных (телячья, бычья, лошадиная), без наличия 5-10% которой размножение клеток и формирование монослоя не происходит. В состав поддерживающих сред сыворотка не входит. С целью предотвращения возможного роста микроорганизмов в питательные среды вносят антибиотики.

Извлеченным из организма клеткам можно создать такие условия, при которых они будут жить и размножаться в искусственной среде (in vitro - вне организма, в отличие от in vivo - в организме), образуя культуру клеток. Клеточные культуры можно получать из таких клеток, которые в составе организма потеряли способность к делению, например из лейкоцитов периферической крови. Изучение поведения клеток в культуре помогает понять механизмы контроля деления клеток. Установлено, что в этом контроле главную роль играют клеточные взаимодействия. Наблюдение за клеточными культурами показало, что клетки активно делятся и расползаются по стеклу сосуда, в котором их культивируют до тех пор, пока они не начнут соприкасаться друг с другом. Контакт поверхностей соседних клеток приводит к остановке их движения и одновременно выключает клетки из размножения. Когда клетки плотным слоем покроют всю доступную им поверхность сосуда, деления прекратятся. Некоторое время клетки будут жить, потом в них начнут возникать всевозможные нарушения, и если часть клеток не пересадить в другой сосуд, на новую среду, то культура погибнет. Интересно, что пересев клеток на новую среду не всегда стимулирует клеточное размножение. Клетки, претерпевшие несколько пересевов, со временем не приступают к делению даже на новой среде. Специальные эксперименты показали, что клетки, взятые из тканей взрослых организмов, способны делиться in vitro меньшее число раз, чем клетки, полученные из эмбрионов. Причину этого явления, названного по имени открывшего его ученого феноменом Хейфлика , многие исследователи видят в старении клеток, и в настоящее время клеточные культуры служат объектом изучения механизмов старения на клеточном уровне. Клетки, взятые из раковых опухолей, ведут себя в культуре немного иначе. Контакт поверхностей клеток не останавливает их делений, они продолжают размножаться и культура становится многослойной. Не подчиняются опухолевые клетки и правилу Хейфлика: они могут претерпевать неограниченное число делений. Некоторые клетки в культуре остаются дифференцированными: синтезируют специфические белки, сохраняют морфологические особенности, например опухолевые клетки лимфоидного происхождения. Другие клетки при переносе их в искусственные условия становятся недифференцированными. Изменение условий выращивания иногда приводит к потере, иногда к приобретению свойств дифференцированных клеток. Это позволяет использовать клетки в культуре для изучения механизмов клеточной дифференцировки. Сохранение некоторыми клетками in vitro дифференцированного состояния послужило толчком для создания клеточных культур с практическими целями для получения из них веществ, которые синтезируются этими клетками. Так получают антитела к различным белкам. Можно получать и лекарственные вещества из клеток тех растений, которые плохо выращиваются на плантациях. Клеточные культуры нашли применение и в медицине. Для диагностики наследственных заболеваний иногда необходимо достаточно большое количество клеток организма для того, чтобы можно было провести биохимический анализ. Если диагноз нужно установить у эмбриона человека, то взятие материала на анализ представляет большую проблему. В этом случае на помощь приходит техника клеточных культур: несколько сотен клеток, взятых из ворсинок оболочки зародыша без вреда для него, достаточно, чтобы вырастить большую клеточную массу. Клеточные культуры используют и в вирусологии - для выращивания вирусов и изучения их свойств, а также в фармацевтической и химической промышленностях для исследования повреждающего действия на ДНК и хромосомы вновь синтезированных химических веществ.

1966 г.).

Методы культивирования клеток получили значительное развитие в 1940-х 1950-х годах в связи с исследованиями в области вирусологии. Выращивание вирусов в культурах клеток дало возможность получения чистого вирусного материала для производства вакцин. Вакцина против полиомиелита стала одним из первых препаратов, массово произведённых с использованием технологии культивирования клеток. В 1954 г. Эндерс , Уэллер и Роббинс получили Нобелевскую премию «За открытие способности вируса полиомиелита расти в культурах различных тканей». В 1952 г. была получена широко известная линия раковых клеток человека HeLa .

Основные принципы культивирования

Выделение клеток

Для культивирования вне организма живые клетки могут быть получены несколькими способами. Клетки могут быть выделены из крови, но к росту в культуре способны только лейкоциты. Моноядерные клетки могут быть выделены из мягких тканей с помощью таких ферментов , как коллагеназа , трипсин , проназа , разрушающих внеклеточный матрикс . Кроме того, в питательную среду можно поместить кусочки тканей и материалов.

Культуры клеток, взятых непосредственно от объекта (ex vivo), называются первичными . Большинство первичных клеток, за исключением опухолевых, имеют ограниченный срок использования. После определённого количества делений клетки такие стареют и прекращают делиться, хотя могут при этом сохранить жизнеспособность.

Существуют иммортализованные («бессмертные») линии клеток, способные размножаться бесконечно. У большинства опухолевых клеток эта способность является результатом случайной мутации , но у некоторых лабораторных клеточных линий она приобретена искусственно, путём активации гена теломеразы .

Культивирование клеток

Клетки выращивают в специальных питательных средах , при постоянной температуре. Для культур растительных клеток используется регулируемое освещение, а для клеток млекопитающих обычно необходима также специальная газовая среда, поддерживаемая в инкубаторе клеточных культур . Как правило, регулируется концентрация в воздухе углекислого газа и паров воды, но иногда также и кислорода. Питательные среды для разных культур клеток различаются по составу, , концентрации глюкозы , составу факторов роста и др . Факторы роста , используемые в питательных средах для клеток млекопитающих, чаще всего добавляют вместе с сывороткой крови . Одним из факторов риска при этом является возможность заражения культуры клеток прионами или вирусами. При культивировании одной из важных задач является исключение или сведение к минимуму использование заражённых ингредиентов. Однако на практике это бывает достигнуто не всегда. Наилучшим, но и наиболее дорогостоящим способом является добавление вместо сыворотки очищенных факторов роста .

Перекрёстное загрязнение клеточных линий

При работе с клеточными культурами учёные могут столкнуться с проблемой перекрёстного загрязнения.

Особенности выращивания клеток

При выращивании клеток, из-за постоянного деления может возникнуть их переизбыток в культуре, и, как следствие, возникают следующие проблемы:

• Накопление в питательной среде продуктов выделения, в том числе токсичных.
• Накопление в культуре омертвевших клеток, прекративших жизнедеятельность.
• Скопление большого количества клеток оказывает негативное влияние на клеточный цикл , рост и деление замедляются, а клетки начинают стареть и отмирать (контактное ингибирование роста).
• По той же причине может начаться клеточное дифференцирование .

Для поддержания нормального функционирования культур клеток а также для предотвращения негативных явлений периодически проводят замену питательной среды, пассирование и трансфекция клеток. Во избежание загрязнения культур бактериями, дрожжами , или другими линиями клеток, все манипуляции обычно проводят с соблюдением правил асептики в стерильном боксе. Для подавления микрофлоры в питательную среду могут быть добавлены антибиотики (пенициллин , стрептомицин) и противогрибковые препараты (амфотерицин B).

Культивирование человеческих клеток несколько противоречит правилам биоэтики , поскольку изолированно выращиваемые клетки могут пережить родительский организм, а затем использоваться для проведения экспериментов или для разработки новых методов лечения и извлечения из этого прибыли. Первое судебное решение в данной области было вынесено в Верховном суде штата Калифорния по делу «Джон Мур против представителей Калифорнийского университета », согласно которому пациенты не имеют никаких прав собственности на линии клеток, полученных из органов, удалённых с их согласия .

Гибридома

Использование клеточных культур

Массовое культивирование клеток является основой для промышленного производства вирусных вакцин и разнообразных продуктов биотехнологии .

Продукты биотехнологии

Промышленным методом из культур клеток получают такие продукты, как ферменты , синтетические гормоны , моноклональные антитела , интерлейкины , лимфокины , противоопухолевые препараты . Хотя многие простые белки относительно просто могут быть получены с использованием рДНК в бактериальных культурах, более сложные белки, такие как гликопротеины, в настоящее время могут быть получены только из животных клеток. Одним из таких важнейших белков является гормон эритропоэтин . Стоимость выращивания культур клеток млекопитающих является довольно высокой, поэтому в настоящее время проводятся исследования по возможности производства сложных белков в культурах клеток насекомых или высших растений .

Тканевые культуры

Культивирование клеток является неотъемлемой частью технологии культивирования тканей и тканевой инженерии, поскольку именно оно определяет основы выращивания клеток и поддержания их в жизнеспособном состоянии ex vivo .

Вакцины

С применением методики культивирования клеток в настоящее время выпускаются вакцины против полиомиелита , кори , эпидемического паротита , краснухи , ветрянки . Вследствие угрозы пандемии гриппа , вызываемого штаммом вируса H5N1 , в настоящий момент правительство Соединённых Штатов финансирует исследования по получению вакцины против птичьего гриппа с использованием клеточных культур.

Культуры клеток не млекопитающих

Культуры клеток растений

Культуры клеток растений, как правило, выращиваются либо в виде суспензии в жидкой питательной среде, либо в виде каллусной культуры на твердой питательной основе. Культивирование недифференцированных клеток и каллуса требует соблюдения определённого баланса гормонов роста растений ауксинов и цитокининов .

Бактериальные, дрожжевые культуры

Основная статья: Бактериальная культура

Для культивирования небольшого количества клеток бактерий и дрожжей клетки высеивают на твердую питательную среду на основе желатина или агар-агара . Для массового производства применяют выращивание в жидких питательных средах (бульонах).

Вирусные культуры

Клеточные культуры

Технология клеточных культур заключается в выращивании клеток вне живых организмов.

Культуры растительных клеток

Культуры растительных клеток не только являются важным этапом создания трансгенных растений, но и экологически приемлемым и экономически оправданым источником природных продуктов, обладающих терапевтическими свойствами, как, например, паклитаксель (paclitaxel), содержащийся в тисовой древесине и выпускаемый как препарат для химиотерапии под названием Таксол (Taxol). Культуры растительных клеток также применяются для производства веществ, используемых пищевой промышленностью в качестве ароматизаторов и красителей.

Культуры клеток насекомых

Изучение и применение культур клеток насекомых расширяет возможности разработки и использования человеком биологических агентов, уничтожающих насекомых-вредителей, но не влияющих на жизнеспособность полезных насекомых, а также не накапливающихся в окружающей среде. Несмотря на то, что достоинства биологических методов борьбы с вредителями были известны уже давно, производство таких биологически активных веществ и патогенных для насекомых и микроорганизмов в промышленных количествах очень затруднено. Использование культур клеток насекомых способно полностью решить эту проблему. Кроме того, так же как и растительные клетки, клетки насекомых могут быть использованы для синтеза лекарственных препаратов. Эта перспектива в настоящее время активно изучается. Кроме того, изучается возможность использования клеток насекомых для производства VLP-вакцин (VLP – virus-like particle – вирусоподобные частицы) для лечения инфекционных заболеваний, таких как атипичная пневмония и грипп. Эта методика могла бы сильно снизить затраты и исключить проблемы безопасности, связанные с традиционным методом, использующим куриные яйца.

Культуры клеток млекопитающих

Клеточные культуры млекопитающих являются одним из главных инструментов, используемых специалистами племенного животноводства в течение уже не одного десятилетия. В лабораторных условиях яйцеклетки, полученные от коров, обладающих выдающимися качествами, оплодотворяются сперматозоидами соответствующих быков. Образующиеся при этом эмбрионы в течение нескольких дней выращиваются в пробирке, после чего имплантируются в матки суррогатных коров-матерей. Этот же прием является основой экстракорпорального оплодотворения человека.

В настоящее время использование культур клеток млекопитающих выходит далеко за рамки искусственного оплодотворения. Клетки млекопитающих могут дополнять, а возможно, когда-нибудь и заменят использование животных для тестирования безопасности и эффективности новых лекарственных препаратов. Кроме того, так же как клетки растений и насекомых, клетки млекопитающих могут быть использованы для синтеза лекарственных веществ, особенно некоторых животных белков, слишком сложных для того, чтобы синтезировать их с помощью генетически модифицированных микроорганизмов. Например, моноклональные антитела синтезируются именно культурами клеток млекопитающих.

Ученые также рассматривают возможность использования клеток млекопитающих для производства вакцин. В 2005 году Министерство здравоохранения и социальных услуг США заключило с компанией Sanofi Pasteur контракт на 97 миллионов долларов США. Задачей специалистов компании является разработка методик культивирования клеток млекопитающих с целью ускорения процесса разработки вакцин против гриппа и, соответственно, повышения готовности человечества к пандемии.

Методы терапии, основанные на использовании культур взрослых стволовых клеток , обнаруженных в некоторых тканях организма (костном мозге, жировой ткани, мозге и др.), также скоро займут достойное место в клинической практике. Исследователи установили, что стволовые клетки могут быть использованы организмом для восстановления поврежденных тканей. Взрослые гемопоэтические стволовые клетки уже давно используются в качестве трансплантатов костного мозга. Они необходимы для восстановления процессов созревания и формирования всех типов клеток крови. Такие клетки могут быть в больших количествах получены из пуповинной крови, однако их выделение является довольно сложным процессом.

В настоящее время исследователи работают над методами выделения стволовых клеток из плаценты и жировой ткани. Ряд специалистов занят разработкой методов клеточного ре-программирования – возвращения в недифференцированное состояние зрелых клеток организма, например, клеток кожи, и последующей стимуляции их дифференцирования в клетки необходимого типа ткани.

Эмбриональные стволовые клетки

Использование эмбриональных стволовых клеток также рассматривается в качестве потенциального метода терапии многих заболеваний. Как понятно из названия, эмбриональные клетки получают из эмбрионов, в частности, тех, что развиваются из яйцеклеток, оплодотворенных in vitro (в клиниках, занимающихся экстракорпоральным оплодотворением) и, с согласия доноров, переданных исследователям для использования в научных целях. Обычно используются бластоцисты – 4-5-дневные эмбрионы, выглядящие под микроскопом как шарики, состоящие из нескольких сотен клеток.

Для выделения человеческих эмбриональных стволовых клеток внутренняя клеточная масса бластоцисты переносится в богатую питательными веществами культуральную среду, где клетки начинают активно делиться. В течение нескольких дней клетки покрывают всю поверхность культуральной плашки. После этого исследователи собирают делящиеся клетки, делят их на части и помещают в новые плашки. Процесс перемещения клеток в новые плашки называется пересевом и может многократно повторяться в течение многих месяцев. Цикл пересева клеток называется пассаж . Эмбриональные стволовые клетки, просуществовавшие в культуре в течение шести и более месяцев без дифференцировки (т.е. остающиеся плюрипотентными – способными дифференцироваться в клетки любой ткани организма) и сохранившие нормальный набор генов, называются линией эмбриональных стволовых клеток .

Внутренняя поверхность культуральной плашки зачастую покрывается клетками кожи мышиных зародышей, генетически модифицированных на неспособность к делению. Эти клетки образуют фидерный слой – «питательную подложку», благодаря которой эмбриональные клетки прикрепляются к поверхности. Ученые пытаются усовершенствовать существующий метод и исключить необходимость использования мышиных клеток, так как их присутствие всегда привносит риск попадания в культуру человеческих клеток вирусных частиц и мышиных белков, способных вызвать аллергическую реакцию.

Максимальная ценность терапии с использованием стволовых клеток и тканевой инженерии может быть достигнута в том случае, если терапевтические стволовые клетки и ткани, выращенные из них, являются генетически идентичными клеткам реципиента. Поэтому, если сам пациент не является их источником, стволовые клетки должны быть модифицированы методом замещения их генетического материала генами реципиента и только потом дифференцированы в клетки специфического типа. На настоящее время процедура замещения генетического материала и ре-программирования может быть успешно проделана только с эмбриональными стволовыми клетками.