Вопросы для самоконтроля. Клеточная инженерия растений

Клеточная селекция

Клеточная селекция основана на высокой изменчивости популяции соматических клеток, усилении изменчивости с помощью различных мутагенов и на разработке селективных систем, позволяющих выявить и отобрать генетически измененные клоны клеток (мутантные, рекомбинантные и др.). Благодаря свойству тотипотентности из этих клеток регенерируют целые растения.

Спонтанные мутации в популяции клеток наблюдаются редко, поэтому для повышения частоты мутаций используют индуцированный мутагенез. Получение мутантных форм при использовании селекции на клеточном уровне складывается из следующих этапов: 1) обработка мутагеном суспензии клеток или протопластов; 2) перенесение суспензии в селективные условия; 3) выделение развивающихся колоний; 4) отбор измененных резистентных к селективному фактору клонов; 5) индукции органогенеза; 6) регенерация измененных растений.

Методом клеточной селекции получены: линии кукурузы, устойчивые к гельминтоспориозу; линии картофеля: резистентные к фитофторе; растения табака, устойчивые к вирусу табачной мозаики. В культуре клеток получены мутанты с повышенным синтезом незаменимых аминокислот. Так, отобраны штампы клеток моркови и табака, синтезирующие в 20-30 раз больше свободного триптофана по сравнению с исходными родительскими культурами. Этим способом получен целый ряд клеточных линий картофеля, моркови, риса, способных к сверхсинтезу лизина, метионина, пролина, фенилаланина, глицина. Это реальный путь создания растений с повышенным содержанием аминокислот, особенно незаменимых. Используя различные селективные системы, можно вести направленную селекцию по различным хозяйственно-ценным признакам, как то устойчивость к гербицидам, болезням, к различным стрессовым воздействиям (засоление, затопление, низкие и высокие температуры и др.)

Для получения мутантов в каждом случае необходимо разработать схему селекции и доказать генетическую природу измененных клеточных линий. Полученные изменения не всегда бывают связаны с мутациями, а могут носить модификационный характер и не наследоваться. Доказательством мутации является совокупность следующих критериев: 1)частота спонтанно измененных клеток должна быть очень низка; 2) она значительно повышается при использовании мутагенов; 3) измененные клетки способны делиться и длительно расти; 4)стабильность измененного признака сохраняется и при отсутствии селективного давления; 5) обнаруживается продукт измененного гена (морфологические и биохимические маркеры).

Эффективность мутагена в культуре тканей повышается на гаплоидном уровне благодаря проявлению всех рецессивных мутаций в ранних поколениях, а также в культуре протопластов из-за их выравненности при изолировании из однородных тканей. Особенно перспективными источником выделения разнообразных мутаций являются протопласты гаплоидных растений.

Мутагенез и клеточная селекция как в случае соматических, так и половых клеток являются эффективными способами получения генетически измененных форм и новых сортов растений.

В результате генетической изменчивости in vitro возникают сомоклональные варианты – растения, отклоняющиеся от родительского типа. Сомоклональная вариабельность имеет несколько причин: перемещение подвижных генетических элементов, инверсии, траслокации, делеции, генные перестройки, связанные с дифференцировкой, соматической кроссинговер. Наследственная изменчивость в культуре клеток может иметь не только генетическую, но и эпигенетическую природу, то есть возникает вследствие изменения действия генов.

Особый интерес представляют сомоклоныльные варианты злаков как источник получения ценных генотипов. Получены линии пшеницы, ячменя, риса, варьирующие по таким очень консервативным признакам, как высота растений, длина остей, окраска зерна, формаколоса, электрофоретические спектры запасных белков. Сомоклональные варианты успешно используются как эффективный источник изменчивости для улучшения сортов сельскохозяйственных культур.

Биотехнология в растениеводстве - улучшение технологий в селекции растений

Современная биотехнология растений - сумма технологий, которые развиты по молекулярной и клеточной биологии растений, - новая стадия в развитии технологии селекции растений. С помощью этих технологий улучшения признаков может происходить на уровне индивидуального гена, а отдельные гены, определяющие определенную признак, могут быть идентифицированы. За ними может быть проведен отбор, их можно изолировать, ввести, удалить или модифицировать в генотипе растения или в сорте. Вклад биотехнологии в сельскохозяйственное производство заключается в облегчении традиционных методов селекции растений, разработке новых технологий, позволяющих повысить эффективность сельского хозяйства. Методами генетической и клеточной инженерии созданы высокопродуктивные и устойчивые против вредителей, болезней, гербицидов сорта сельскохозяйственных растений. Разработано технику оздоровления растений от накопления инфекций, что особенно важно для культур, которые размножаются вегетативно (картофель и др.). Одной из актуальных проблем является возможность управлять процессом азотфиксации, в том числе возможность введения генов азотфиксации в геном полезных растений, а также управления процессами фотосинтеза. Ведутся исследования по улучшению аминокислотного состава растительных белков, разрабатываются новые регуляторы роста растений , микробиологические средства защиты растений от вредителей и болезней, бактериальные удобрения. На современном этапе развития селекции для его интенсификации эффективное использование таких биотехнологических методов, как культура изолированных тканей, клеток и органов растений, клеточная селекция и генетическая инженерия, которые дают возможность за сравнительно короткие сроки создать и размножить ценный исходный высокопроизводительный материал, гетерозисных гибриды и сорта сельскохозяйственных растений. Разработка основ метода культуры тканей растительных организмов имеет сравнительно короткую историю и начинается с исследований, выполненных Габерландтом в 1902 г. Однако каждое открытие, сделанное в этой области, нашло применение в прикладных исследованиях.

Все проблемы, которые разрабатывают в культуре in vitro, можно разделить на три основные группы: n сохранения генетической информации клеток (микроклональное размножения растений и депонирования, культура зародышей, пыльников и семенных зачатков); n изменение генетической информации способом мутагенеза под влиянием физических и химических факторов (культура каллуса, клеточных суспензий, изолированных протопластов); n перенос и восстановление генетической информации (генно-инженерное конструирование растений с новыми признаками, соматическая гибридизация).

Одним из распространенных направлений метода культуры тканей является микроклональное размножения, при котором получают генетически идентичны формы, что способствует сохранению генетически однородного посадочного материала. Как эксплантатов можно использовать пазушные почки, молодые листья, некоторые элементы цветов и соцветий. Однако такой вид размножения требует конкретизации метода для каждой сельскохозяйственной культуры в связи с особенностями ее генотипа. Технология микроклонального размножения любой культуры объединяет четыре основных этапа: ввод исходной формы в стерильную культуру, собственно микроразмножения, укоренение размноженных побегов, перевод стерильной культуры в условиях открытого грунта. Разработка средств вегетативного размножения элитных растений, гетерозисных гибридов и сортов in vitro позволяет решить проблему быстрого размножения форм, имеющих практическую ценность, а также сохранения материала для использования в рекуррентные селекции.

Микроклональное размножения имеет определенные преимущества по сравнению с традиционными методами размножения: выращивание в искусственных условиях (контролируемых) с меристематических тканей позволяет достичь извлечения вирусов и других патогенных микроорганизмов и получить здоровый посадочный материал; рост растений можно поддерживать в течение многих лет; методом культуры можно размножать формы, не размножаются вегетативно или не дают жизнеспособного семян; можно выбирать генотипы, устойчивые к неблагоприятным условиям выращивания: экстремальные температуры, засуха, засоление и закисление субстрата, угнетающее действие гербицидов и др., а также отбор продуктивных форм в условиях in vitro, скорость и коэффициент размножения достигает 1 :1000000 и дает возможность вдвое-втрое сократить сроки отбора и получения новых растений в селекционных исследованиях.

На современном этапе существует несколько различных детально разработанных методов микроклонального размножения. Различаются они по состоянию исходных клеток и тканей, которые принимают для получения микроклонов. Важнейшим требованием технологии является гарантирование полной стерильности и оптимальных условий для клеточного деления и дифференциации исходной ткани. Затем следует добиться образования большого количества микроклонов и обеспечить их укоренения. Чтобы эффективность микроклонального размножения была высокой, нужно на всех этапах поддерживать оптимальные условия выращивания. Для этого для каждой культуры разрабатывают конкретную методику микроклонального размножения.

Укоренившиеся растения в случае необходимости размещают на депонирование пониженных температур. Это очень важный процесс, поскольку он позволяет задерживать развитие растений и таким образом длительное время сохранять их без пересадки, используя при необходимости. Для переноса стерильных растений в почву надо отбирать среди них здоровые, со светлой, хорошо развитой корневой системой. В репродуцированные культуре тканей видимых морфологических отклонений нет. Генетическая стабильность изолированной культуры наблюдается даже после многократных пассажей, что открывает новые возможности в сохранении генофонда сельскохозяйственных растений. Сохранение и дальнейшее размножение растений в культуре in vitro приобретает большое значение в связи с рекуррентным отбором, поскольку без него невозможно создание гибридов на ЧМ-основе (чоловичостерильний основе). Из выращенных с помощью культуры in vitro маточных растений и корнеплодов получают высококачественные семена. В селекционной практике одновременно с микроклональное размножение растений широко используют метод каллусных культур из эксплантов различных органов, которые являются дополнительным резервом размножения селекционного материала. Он дает возможность практически использовать в селекционном процессе новый тип изменчивости - сомаклональну изменчивость. Каллусных культуры многих сельскохозяйственных растений характеризуются большой нестабильностью. Генетическая вариабельность соматических клеток является одной из причин неоднородности растений, полученных из каллусных тканей. Калусогенезу - это первый этап на пути получения сомаклональних вариантов требует перепрограммирования способов развития клетки. Клетка, переведенная в условия культивирования in vitro, сохраняет свою основную генетическую информацию о целом организм и при наличии соответствующих условий может реализовать ее. Однако физические и химические факторы культивирования, обладают мутагенным действием, а также генетическая гетерогенность соматических клеток эксплантатов создают предпосылки для получения генетически измененных растений. Метод получения сомаклональнои изменчивости позволяет индуцировать не только изменчивость генома, но и плазмоны. В основе феномена сомаклональнои изменчивости лежат сложные процессы структурной и функциональной перестройки генетического аппарата клеток. Используя его, уже получено формы многих сельскохозяйственных культур с ценными признаками. Одной из важных проблем в селекционно-генетических исследованиях перехреснозапильних растений является использование гетерозиса. Основной и наиболее эффективный метод получения стабильных линий является экспериментальная гаплоидия. Исключая многократное самоопыления растений, она позволяет получать гомозиготный материал из обогащенных в генетическом отношении гибридов. Для получения гаплоидных растений используют культуру пыльников, завязи и семенных зачатков. Индукция гаплоидов зависит от генетических свойств растений-доноров, фазы развития семенников, размещение цветоносов на растении и ряда других факторов. Увеличение количества гаплоидов наблюдается в случае изъятия неоплодотворенных семенных зачатков из раскрытых цветков, а также в случае опыления облученным пыльцой донорских растений. Гаплоидов обнаружено во многихсельскохозяйственных культур . Способ получения их в культуре in vitro дает возможность использовать явление гаплоидии не только в генетических исследованиях, но и в практической селекции.

Гетерогенность клеточной популяции суспензионных культур дает возможность получить значительную вариабельность признаков у растений-регенерантов и открывает широкие возможности для генетических и селекционных исследований. Химические компоненты питательной среды и физические условия могут выступать и как мутагенные, экстремальные факторы, вызывающие изменения в нуклеиновых и белковом обменах, структуре, форме и функциях клетки. В данном случае клеточная популяция в условиях культуры in vitro характеризуется физиологической, цитологической и генетической гетерогенностью. Появляются мутанты с измененным морфогенезом, которые можно опереться в селекционно-генетических исследованиях. По клеточной селекции отбор клеточных линий и растений с новыми унаследованными признаками осуществляют на уровне клеток, культивируемых in vitro. Способы культивирования растительных клеток и регенерация из них растений разработаны для многих важных сельскохозяйственных растений. Перечень мутантов с важными сельскохозяйственными признаками, селекцию которых осуществляют на клеточном уровне, очень велик. К ним относятся мутанты, устойчивые к стрессовым факторам, гербицидов, различных заболеваний, засоление и закисление субстрата.

В связи с тем, что возможности совершенствования растений с помощью рекомбинации практически неисчерпаемы, главной задачей является поиск методов управления этим процессом и эффективного выбора ценных генотипов с желаемым комплексом признаков и свойств. Это стало возможным благодаря разработке методов клеточной и генетической инженерии - культуры протопластов и соматической гибридизации и введения генетического материала в растительные клетки и протопласты с помощью трансформируемой ДНК. Первым этапом в этом направлении исследований является разработка метода получения и культивирования жизнеспособных протопластов. Получение жизнеспособных протопластов обусловлено многими факторами, а именно: состав и концентрация ферментов, выбор осмотического раствора, рН-среды, физиологическое состояние ткани, условия перединкубацийнои культивирования. Выделенные протопласты в дальнейшем используют для получения соматических гибридов и соматических цибридов, пересадки органелл, ввод чужеродной информации. Слияние протопластов и соматическая гибридизация позволяют: n скрещивать филогенетически отдаленные виды растений, которые невозможно скрестить обычным половым способом; n получать асимметричные гибриды, которые несут весь генный набор одного из родителей вместе с несколькими хромосомами (или несколькими генами или только органеллами и цитоплазмой) второго; n создавать систему гибридизации, которая исключает одновременно слияния трех и более родительских клеток; получать растения, гетерозиготные по неядерными генами; n преодолевать ограничения, налагаемые генеративных системами несовместимости; n скрещивать формы, которые невозможно гибридизировать половым способом через аномалии в морфогенезе или гаметогенезе родителей; n гибридизировать клетки, несущие различные эпигенетические программы. Используя метод соматической гибридизации изолированных протопластов, селекционеры выводят гибриды от физиологически несовместимых видов сельскохозяйственных культур.

Главными факторами, которые повышают производительность сельского хозяйства , является совершенствование способов выращивания растений, создание продуктивных сортов, улучшения питания растений и защиту урожая. Большое значение для повышения урожая и его сохранности принадлежит также удобрениям и средствам защиты растений. Генетическая инженерия открывает перед селекцией растений новые перспективы, связанные с возможностью переноса в них генов от бактерий, грибов, экзотических растений и даже человека и животных, что является недостижимым для экспериментального мутагенеза и традиционной селекции, в том числе и генов устойчивости. Революционным свершением в генетической трансформации растений стало обнаружение природного вектора - агробактерий для переноса генов и разработка метода микробомбардування растительных объектов микрочастицами металлов с предварительно нанесенной чужеродной ДНК. Три выдающиеся достижения физиологии растений создали основу для интеграции технологии рекомбинантных ДНК в генно-инженерной биотехнологии растений. Во-первых, открытие фитогормонов, регулирующих рост и развитие растений. Во-вторых, разработка методов культивирования клеток и тканей растений in vitro (эти методы дали возможность выращивать клетки, ткани и целые растения в стерильных условиях и проводить их селекцию на селективных средах). В-третьих, установление феномена тотипотентности соматических растительных клеток, который открыл путь к регенерации из них целых растений.

На сегодня генетическая инженерия сельскохозяйственных растений развивается преимущественно в русле классической селекции. Основные усилия ученых сосредоточены на защите растений от неблагоприятных (биотических и абиотических) факторов, снижении потерь при хранении и улучшении качества продукции растениеводства. В частности, это повышение устойчивости к болезням и вредителям, заморозков или засоления почв, удаления нежелательных компонентов из растительных масел, изменение свойств белка и крахмала в пшеничной муке, улучшения лежкости и вкусовых качеств плодов томата и т.д. Сравнению с традиционной селекцией, основные инструменты которой - скрещивание и отбор, главные преимущества генной инженерии - возможность использования принципиально новых генов, определяющих агрономически важные признаки и новые молекулярно-генетические методы мониторинга трансгенов (молекулярные маркеры генов), которые во много раз ускоряют процесс создания трансгенных растений. Селекционеров привлекает возможность целенаправленного генетического "ремонта" сельскохозяйственных растений. Важным направлением является создание генетически модифицированных растений (ГМР) с признаком мужской стерильности. Кроме того, благодаря генетической модификации, растения могут выполнять не свойственную им ранее роль. Это, например, корнеплоды сахарной свеклы, накапливающих, вместо сахарозы, низкомолекулярные фруктозы, или бананы, которые используют как съедобную вакцину. Благодаря введению генов бактерий, высшие растения приобретают свойства участвовать в разрушении чужеродных органических соединений (ксенобиотиков), которые загрязняют окружающую среду. Выращивание ГМР, устойчивых к широкому спектру болезней и насекомых-вредителей, может существенно снизить, а в дальнейшем свести к минимуму пестицидную нагрузки на окружающую среду. Рост площадей под трансгенными культурами в развитых странах происходит намного интенсивнее, чем в развивающихся странах. На сегодня украинские селекционеры испытывают трансгенные сорта кукурузы, сахарной свеклы и рапса, устойчивые к гербицидам; кукурузы, устойчивой к кукурузного мотылька; и картофеля, устойчивого к колорадскому жуку. Создана система органов с привлечением генетиков, селекционеров, генных инженеров, экологов, медиков, токсикологов, которые оценивают трансгенные сорта для определения потенциального воздействия на человека, животных и окружающую среду. И только после таких экспертиз сорта будут допущены к испытанию с соблюдением всех требований к трансгенных сортов узаконенных в Европейском Союзе. При рассмотрении проблемы возможного влияния трансгенных растений на окружающую среду специалисты, в основном, обсуждают такие важные аспекты: n сконструированы гены будут переданы с пыльцой близкородственными диким видам, и их гибридное потомство приобретет свойства повышенной семенной продуктивности или способности конкурировать с другими растениями; n трансгенные сельскохозяйственные растения станут сорняками для сельского хозяйства и вытеснят растения, растущие рядом; n трансгенные растения станут прямой угрозой человеку, домашним и диким животным (например, ввиду своей токсичности или аллергенности). Еще одним аспектом влияния трансгенных растений на окружающую среду является получение трансгенных растений с лучшей способностью использовать минеральные соединения, что, кроме усиления роста, будет препятствовать их смыванию в грунтовые воды и попадание в источники водоснабжения.

Микроорганизмы существенно отличаются друг от друга по морфологии, размерам клеток, отношению к кислороду, по потребностям к ростовым факторам, способности ассимилировать разные компоненты субстрата и т. д.
Из более 100000 известных видов микроорганизмов в промышленности используют относительно мало – около 100 видов. Они должны соответствовать следующим требованиям:
1. Расти на дешёвых и доступных субстратах;
2. Обладать высокой скоростью роста биомассыи давать высокую продуктивность целевого продукта при экономичном потреблении питательного субстрата;
3. Проявлять направленную биосинтетическую активность при минимальном образовании побочных продуктов (рис. 2.1);

Рис. 2.1.Микроорганизмы, используемые в промышленном синтезе различных соединений
А – Аcetobacter aceti ; Б – Aspergillus niger ; В – Penicillium chrysogenum ; Г – Lactobacillus delbruecki ; Д – Производство левана при ферментации среды, содержащей Zymomonas mobilis

4. Быть генетически однородными, стабильными в отношении продуктивности и требований к питательному субстрату, а такжеусловиям культивирования;
5. Быть устойчивыми к фагам и другой посторонней микрофлоре;
6. Быть безвредными (не обладать патогенными свойствами) для людей и окружающей среды;
7. Желательно, чтобы продуценты были термофильными и ацидофильными, так как в этом случае легче предохранить ферментируемый субстрат от инвазии посторонней микрофлоры;
8. Целевой продукт биосинтеза должен иметь экономическую и народнохозяйственную ценность и легко выделяться из сброженного субстрата.
Возрастающий интерес представляют анаэробные микроорганизмы, поскольку при культивировании не требуют энергоёмких аэрирующих устройств.
Сверхсинтез, т. е. способность микроорганизма синтезировать определённый продукт в количествах, превосходящих его физиологические потребности, довольно часто встречается в природе. Нередко тот или иной продукт обмена веществ (органические кислоты, спирты, антибактериальные вещества), выделяемый микроорганизмом в окружающую среду, является токсичным для других видов и служит продуценту как средство защиты обитаемого пространства или как резерв питательного вещества. Микроорганизмы с такими свойствами первыми были привлечены к хозяйственной деятельности человека в тысячелетней давности и был проведён стихийный отбор наиболее продуктивных форм. Сейчас такие природные штаммы микроорганизмов, иногда после сознательного отбора, применяют для производства микробной биомассы (микробного белка) в качестве бактериальных азотных удобрений, биопестицидов, в производстве пищевых продуктов и в других отраслях народного хозяйства. Однако основной контингент промышленных микроорганизмов представлен искусственно селекционными штаммами.
В настоящее время впромышленности применяют три вида штаммов:
1. Природные штаммы, нередко улучшенные естественным или искусственным отбором;
2. Штаммы, изменённые в результате индуцированных мутаций;
3. Штаммы культуры, полученные методами генной или клеточной инженерии.
Принципы селекции организмов. Начиная сознательную селекцию микроорганизмов, человек ставил целью создать промышленные организмы с необычными для диких микробов свойствами. Методологически эту цель человек решает двумя путями:
1. Коррекцией генетической информации микробной клетки, исключая не желаемые для промышленного синтеза свойства и усиливая нужные признаки.
2. Индукцией совершенно новой информации в генетической программе клетки.
Для этого необходимо также решить следующие задачи:
1. Существенно увеличить продуктивность, свойственную данному виду микробов и его продукту обмена веществ;
2. Генетически запрограммировать биосинтез таких веществ, которые несвойственны данному виду или даже несвойственны микробному миру.
В отличие от селекции культурных растений и домашних животных, имеющей тысячелетнюю историю и богатый опыт, целенаправленный отбор и селекция микроорганизмов начались только после узнавания микромира и развивались параллельно с достижениями генетики как научной дисциплины.
Селекционируя любой живой организм, человек опирается на естественные движущие силы эволюции – наследственные изменения и отбор положительных экземпляров. Однако микроорганизмы, как объект селекции, имеют ряд особенностей:
1. Выращивание микробной культуры из одной клетки – обычный для микробной селекции приём – приводит к тому, что в руках селекционера в качестве исходного материала селекции всегда оказывается особь клона (имеющего генетическую однообразность). С другой стороны, клон микроорганизмов быстро достигает такой численности, что за счёт естественных мутаций превращается в популяцию – совокупность клеток с разными генотипами;
2. Большинство микроорганизмов гаплоидные, с одним экземпляром хромосом, поэтому у них нет скрытой изменчивости, являющейся основой селекции высших организмов;
3. У большинства микроорганизмов, имеющих промышленное значение, до сих пор не известна способность к гибридизации (половому размножению). Это означает, что селекцию клеток можно вести только вегетативным путём;
4. Микроорганизмы характеризуются исключительно быстрой сменой поколений, поэтому возможностей для отбора положительных экземпляров у селекционера микробиолога значительно больше. Оценку выбранного микроорганизма можно провести за считанные дни выращивания в отличие от макроорганизмов, где результаты работы видны через несколько лет;
5. Селекционер микроорганизмов имеет огромное число индивидуумов для отбора, что принципиально расширяет его возможности, но для оценки продуктивности каждого клона требуется трудоёмкая работа.
Культуру, подлежащую селекции, можно выбрать из собранных в коллекции культур (музейные культуры); можно использовать известные промышленные продуценты; можно изолировать микробы из природных субстратов.

Представления о биохимии и физиологии микроорганизмов ориентируют селекционера на определённые группы микроорганизмов с наиболее вероятным потенциалом сверхсинтеза интересующего вещества. Продуценты антибиотиков, главным образом, встречаются среди грибов аскомицетов и актиномицетов, сверхсинтез аминокислот легче получить у коринебактерий, внеклеточные ферменты часто синтезируют дрожжи. Главные этапы селекции микроорганизмов отражены на рисунке 2.2.

Рис. 2.2. Схема селекции микроорганизмов

Таблица 2.1. Группы методов клеточной технологии

Клеточная технология в селекции растений. Ускорение и облегчение селекционного процесса, а также создание растений с новыми качествами – это направления, которые достаточно успешно развиваются с помощью биотехнологических методов клеточной инженерии, культуры клеток и тканей.
Две группы методов, данной технологии, представлены в табл. 2.1.
Первые три, из указанных методов, стали традиционными, другие находятся на начальных этапах разработки. Наконец, есть такие методы, которые явно вышли из ранга вспомогательных, ускоряющих селекцию технологий. К ним можно отнести криосохранение генофонда – технологию, в настоящий момент приобретшую экологическую направленность; или клональное микроразмножение растений, тесно связанное с проблемой их оздоровления от вирусных и других инфекций.
Методы клеточной инженерии позволяют значительно ускорить традиционный процесс селекции. Биотехнология позволяет также скрещивать растения, которые в обычных условиях не скрещиваются рис. 2.2. – 2.6.
Одна из наиболее важных технологий, из перечисленных выше – оплодотворение in vitro , помогает предотвратить прогамную несовместимость , которая может быть вызвана рядом следующих причин:
1. Генетически детерминированное (определённое) несоответствие секрета рыльца материнского растения и пыльцы отцовского, которое тормозит рост пыльцевых трубок на рыльце пестика;
2. Несоответствие длины столбика пестика и пыльцевой трубки, в результате чего пыльцевая трубка не достигает семяпочки (гетеростилия);
3. Тканевая несовместимость партнёров, приводящая к остановке роста пыльцевой трубки в любой момент её прорастания, от рыльца пестика до микропиле семяпочки (гаметофитный тип несовместимости).
Преодоление прогамной несовместимости возможно благодаря выращиванию в стерильных условиях изолированной завязи с нанесённой на неё пыльцой или изолированных кусочков плаценты с семяпочками, рядом с которыми, или непосредственно на ткани которых, культивируется пыльца.
Значительным препятствием в селекции служит постгамная несовместимость , вызванная разновременным развитием зародыша и эндосперма при отдалённой гибридизации. В результате образуются невсхожие щуплые семена. Получить растение из таких семян можно только при использовании метода эмбриокультуры, т.е. выращивания изолированного зародыша на искусственной питательной среде in vitro. Метод эмбриокультуры широко применяют при межвидовой гибридизации овощных растений, для микроразмножения ценных гибридов, для клеточной селекции.
Большое значение имеет создание гаплоидов , позволяющее ускорить процесс селекции в 2-3 раза. Использование гаплоидных клеток и гаплоидных растений способствует обнаружению экспрессии введённого в клетку генома, редких рекомбинаций, рецессивных мутаций, которые в диплоидных растениях, как правило, маскируются доминантными генами. Из гаплоидных клеток можно выделить протопласты; сливаясь, они образуют гибридные клетки и растения с диплоидным числом хромосом. Обрабатывая гаплоидные клетки колхицином, можно добиться удвоения числа хромосом и получить диплоидные гомозиготные растения.

Методы создания дальнородственных гибридов

На данный момент большую роль в развитии растениеводства играет использование достижений генной инженерии и биотехнологии. Существует ряд мнений, биотехнология и генетически модифицированные растения на современном этапе выращивания растениеводческой продукции позволят решить экологические, энергетические и продовольственные проблемы, стоящие перед человечеством, посредством создания и использования новых организмов, продуктов, полученных с помощью методов генной инженерии, культуры органов и тканей in vitro и др.

Биотехнология и генная инженерия - науки, смотрят в будущее человечества...

Современная биотехнология растений - сумма технологий, развитые с молекулярной и клеточной биологии растений - является новой стадией в развитии технологии селекции растений. С ее помощью улучшения признаков может проходить на уровне индивидуального гена. Отдельные гены, которые определяют определенный признак, могут быть идентифицированы, изолированы, введенные, исключены или модифицированы в генотипе или сорте растения, за ними может проводиться отбор.

Вклад биотехнологии в растениеводство заключается в облегчении традиционных методов селекции растений, разработке новых технологий, позволяющих повысить эффективность сельскохозяйственного производства. Методами генной и клеточной инженерии созданы высокопроизводительные и устойчивые против вредителей, болезней и других негативных факторов сорта сельскохозяйственных растений. Разработанная техника оздоровления растений от инфекций, что особенно важно для культур, которые размножаются вегетативно. Ведутся исследования по улучшению аминокислотного состава растительных белков, разрабатываются новые регуляторы роста растений, микробиологические средства защиты последних от вредителей и болезней, бактериальные удобрения. Одним из актуальных вопросов биотехнологии является управление процессами азотфиксации и фотосинтеза, возможность введения соответствующих генов в геном культурных растений.

На современном этапе развития для интенсификации селекции эффективно использование таких биотехнологических методов: культура изолированных тканей, клеток и органов растений, клеточная селекция и генная инженерия. Они дают возможность за короткий срок создать и размножить ценный исходный высокопроизводительный материал, гетерозисных гибриды и сорта сельскохозяйственных растений. Разработка основ метода культуры тканей растительных организмов имеет сравнительно короткую историю и начинается с исследований, выполненных Габерландт в 1902 году. Однако каждое открытие, сделанное в этой области, нашло применение в прикладных исследованиях. Все проблемы, которые решаются в культуре in vitro, можно разделить на три основные группы:

1) сохранение генетической информации клеток (микроклональное размножения и депонирование, культура зародышей, пыльников и семенных зачатков)

2) изменение генетической информации путем мутагенеза под влиянием физических и химических факторов (культура каллуса, суспензий, протопластов)

3) перенос и интеграция генетической информации (генно инженерное конструирование растений с новыми признаками, соматическая гибридизация).

Основные направления развития биотехнологии в растениеводстве: 1) повышение содержания белка и незаменимых аминокислот в продукции сельскохозяйственных растений, достигается созданием так называемых генетически модифицированных организмов (ГМО), прежде всего трансгенных растений. Они приобретают хозяйственно-ценных признаков, в результате переноса генов, которые предопределяют, в частности от бактерий. Приоритетным признано вывода азотфиксирующих сортов зерновых культур; 2) получение бактериальных удобрений (азотфиксирующих бактерий), биопестицидов; 3) создание сортов и гибридов культурных растений, устойчивых к болезням, вредителям. Так, в США выращивают растения томатов, картофеля, хлопчатника, что приобрели устойчивость к насекомым; растения томатов, картофеля, устойчивые к патогенным вирусам. Получены сорта растений, устойчивых к гербицидам сплошного действия, что значительно облегчает борьбу с сорняками и удешевляет технологию выращивания, поскольку исчезает необходимость в применении селективных гербицидов.

Следует отметить, что среди ученых нет единодушия относительно возможного эффекта исследований по генной инженерии, влияния их на здоровье и безопасность человека, а также на функционирование экологических систем.

Существуют крайние взгляды, согласно которым биотехнология должна быть запрещена, поскольку знания о ней недостаточны для обеспечения полной безопасности человека. Высказывается и противоположное мнение: применение генной инженерии безопасное и требует минимального контроля. При этом основным аргументом является то, что принципиального различия между генной инженерией и селекцией нет. К тому же при генной инженерии выполняются известные, заранее спланированные модификации, а скорость процесса выше.

Свидетельством высоких темпов развития биотехнологии является, в частности, то, что в 1997г. В США и Канаде трансгенные кукурузу, сою, рапс, сахарная свекла выращивали на миллионах гектаров. Трансгенная соя только в США занимала 12%, кукуруза - 6, хлопчатник - 13% всех посевных площадей этих культур.

По заключению экспертов ФАО, в 2030 г.. Весь прирост производства продукции растениеводства будет достигнуто за счет новых сортов растений.

Ведущее место в биотехнологических исследованиях заняли корпорации "Дюпон", "Новартис", "Монсанто", "Рон-Пуленк", "Карсил".

Генетическая инженерия открывает перед селекцией растений новые перспективы, возможность переноса в них генов от бактерий, грибов, экзотических растений и даже человека и животных, в том числе и генов устойчивости, является недостижимым для экспериментального мутагенеза и традиционной селекции. Революционным свершением в генетической трансформации растений стало обнаружение природного вектора - агробактерий для переноса генов и разработка метода микробомбардування растительных объектов микрочастицами металлов с предварительно нанесенной чужеродных ДНК. Три выдающиеся достижения физиологии растений создали основу для интеграции технологии рекомбинантных ДНК в генно-инженерную биотехнологии растений. Во-первых, открытие фитогормонов, которые регулируют рост и развитие растений. Во-вторых, разработка методов культивирования клеток и тканей растений in vitro (эти методы дали возможность выращивать клетки, ткани и целые растения в стерильных условиях и проводить их селекцию на селективных средах). Потро, установление феномена тотипотентности соматических растительных клеток, который открыл путь к регенерации из них целых растений.

На сегодняшний день генетическая инженерия сельскохозяйственных растений развивается преимущественно в русле классической селекции. Основные усилия ученых сосредоточены на защите растений от неблагоприятных (биотических и абиотических) факторов, улучшении качества и уменьшении потерь при хранении продукции растениеводства. В частности, это повышение устойчивости к болезням, вредителям, заморозков, солонцеватости почвы и т.д., удаление нежелательных компонентов из растительных масел, изменение свойств белка и крахмала в пшеничной муке, улучшения лежкости и вкусовых качеств овощей и др. По сравнению с традиционной селекцией, основными инструментами которой являются скрещивания и отбор, генная инженерия дает возможность использования принципиально новых генов, которые определяют агрономически важные признаки, и новых молекулярно-генетических методов мониторинга трансгенов (молекулярные маркеры генов), что во много раз ускоряют процесс создания трансгенных растений. Селекционеров привлекает возможность целенаправленного генетического "ремонта" растений. Важным направлением является создание генетически модифицированных растений (ГМР) с признаком мужской стерильности. Кроме того, благодаря генетической модификации растения могут выполнять не свойственную им ранее функцию. Примером является корнеплоды сахарной свеклы, которые накапливают вместо сахарозы низкомолекулярные фруктами, бананы, которые используют как съедобную вакцину. Благодаря введению генов бактерий высшие растения приобретают свойства разрушать чужеродные органические соединения (ксенобиотики), загрязняющих окружающую среду. Выращивание ГМР, устойчивых к широкому спектру болезней и насекомых-вредителей, может существенно снизить, а в дальнейшем свести к минимуму пестицидную нагрузки на окружающую среду.

При рассмотрении проблемы возможного влияния трансгенных растений на окружающую среду обсуждаются в основном такие основные аспекты:

Сконструированы гены будут переданы с пыльцой близкородственными диким видам, и их гибридное потомство приобретет свойства повышенной семенной продуктивности и способность конкурировать с другими растениями;

Трансгенные сельскохозяйственные растения станут сорняками и вытеснят растения, которые растут рядом;

Трансгенные растения станут прямой угрозой для человека, домашних и диких животных (например из-за их токсичности или аллергенности).

Еще одним важным аспектом является получение трансгенных растений с лучшей способностью использовать минеральные вещества, что, кроме усиления их роста, будет препятствовать смыва таких соединений в грунтовые воды и попадание в источники водоснабжения.

Гарантией против нежелательных последствий генетической модификации растений является законодательное регулирование распространения ГМР и разработка связанных с этим методов оценки экологического риска. Кроме того, значительная внимания уделяется достаточное информированности агрономов, селекционеров, СЕМЕНОВОД, потенциальных покупателей об особенностях продуктов из генетически модифицированных растений. В Украине и ряде других стран приняты законы, которые предупреждают несанкционированное распространение трансгенных семенного материала, обеспечивающего мониторинг в посевах, а также маркировки пищевых продуктов, изготовленных из продуктов ГМР или их добавлением.

В Украине законодательно не разрешено выращивать генетически модифицированные сорта. Это, возможно, одно из правильных решений, которое было принято в области аграрной политики. Будет большой ошибкой для Украины переход к выращиванию ГМ-сортов уже сейчас. Есть еще много нереализованных резервов роста урожайности за счет технологических мероприятий. Не вдаваясь в дискуссию о вреде или безвредности генетически модифицированных сортов, следует отметить, что они для Украины еще не время, потому что не будут способствовать ни росту урожайности, ни улучшению экономических показателей. Только создадут проблему с выходом сельскохозяйственной продукции на мировой рынок, снизят ее цену и возможность реализации.

Биотехнология - важный, но не единственный элемент научно-технического прогресса в аграрном секторе, поэтому необходим комплексный подход к этому вопросу с учетом альтернативных технологий. Одним из таких направлений развития является органическое земледелие.

Плодородие почвы создает " живое вещество " , которая состоит из миллиардов почвенных бактерий, микроскопических грибков, червей и других живых организмов. Переделывая органические растительные остатки и минеральные вещества, бактерии обеспечивают питание червей, которые существенно улучшают структуру и плодородие грунта.

Суть плодородия почв заключается в "" кормления бактерий и других живых существ ", которые живут в фунте. Необходимо накормить сначала микробов и червей, а они, в свою очередь, накормят растения. Ни минералы, ни органика, сами по себе не переходят в усваиваемую форму. Эту функцию выполняют жители фунтов, о которых и необходимо заботиться в первую очередь. Такая постановка вопроса в проблеме фунтов требует от агрономов изменения фадицийного мышления, отказа от глубокой отвальной вспашки. Интенсивная химизация полей уничтожила микрофлору и животных фунт сообщества, которые являются основными воспроизводителями плодородия грунта.

Почвы, в которых преобладают анабиотических или регенеративные микроорганизмы, является исключительно плодородными. Растения, выросшие на таких фунтах, прекрасно развиваются, они здоровые, устойчивые к болезням и вредителям. Такие фунты без всяких химикатов, пестицидов и искусственных удобрений демонсфують постоянное увеличение плодородия. Если же в фунте преобладают дегенеративные или патогенные микроорганизмы, развитие растений ослаблен, они не устойчивы к различным заболеваниям и вредителям и требуют допинга в виде искусственных удобрений и пестицидов. К сожалению, такой деградировавший, истощенное состояние фунтов имеет тенденцию к расширению даже в странах с высоким уровнем агротехнологий. Интенсивная химизация полей, применение пестицидов и искусственных удобрений, вместе с тяжелым сельскохозяйственным оборудованием, уничтожают микрофлору грунта.

Практика показала, что улучшить питательный режим фунтов, преодолеть вредителей и болезни сельскохозяйственных культур массовым применением химических средств не удается. В естественных, здоровых агроценозах растение живет в окружении полезных микроорганизмов, и только они способны воспроизводить среду, поддерживать нужный для комфортного существования живых существ баланс питательных веществ, а значит - максимально реализовывать потенциал урожайности.

Кроме экологических факторов влияют и чисто экономические: производство и внесения удобрений и СЗР пофебуе значительных энергозатрат. К примеру, в развитых странах на производство азотных удобрений вифачають почти фетину энергии, потребляемой в сельском хозяйстве. Не меньшую проблему представляет и дефицит сырья для производства фосфорных удобрений, обусловливает их высокую стоимость.

Поэтому в мире популяризируются идеи биоорганической земледелия, при котором применение химических удобрений и пестицидов допускается минимально или совсем не допускается. Сейчас мировой рынок биотехнологий для сельского хозяйства и пищевой промышленности оценивается почти в 50 млрд. Американских долларов и ежегодно растет на 20-30%.

Нужно учитывать тот факт, что генетически модифицированные сорта до сих пор почти не выращивают в Европе. Есть только экспериментальные посевы на площади 1-3 тыс. Га. Только в Испании отведено площади до 100 тыс. Га. Но это незначительное количество общей пашни в Европе (В. В. Лихочвор, 2001 и 2006).

Клеточные технологии в селекции растений . Обогащение генофонда зерновых культур может быть достигнута при использовании огромных генетических ресурсов их дикорастущих сородичей. Найдены виды злаков с высокой устойчивостью к:

болезням и вредителям,
температурным и водным стрессам,
засолению и высокой кислотности почв.

В селекционной работе для преодоления межвидовой (или даже межродовой) несовместимости применяют методы:

оплодотворения in vitro,
культуру зародышей,
возвратные скрещивания и другие современные приемы (Feldman, Sears, 1984).

Генная инженерия растений создает совершенно новый механизм генетической изменчивости - трансгеноз , который в отличие от ранее существовавших (рекомбиогенез, мутагенез) характеризуется возможностью переноса отдельных генов. Правда, эта особенность затрудняет применение методов генной инженерии для улучшения ряда хозяйственно ценных признаков, наследуемых полигенно. Но уже получены химерные растения, несущие гены устойчивости к болезням, насекомым, гербицидам и др. (Кильчевский, Хотылева, 1997).

Отдаленная гибридизация культурных злаков с дикорастущими сородичами имеет целью перенос единичных генов или небольших фрагментов хромосом от дикорастущих в геном культурных видов. Но для этого необходимо преодолеть барьер несовместимости - отсутствие конъюгации хромосом в мейозе. У пшеницы в хромосоме 5В были обнаружены гены, влияющие на конъюгацию хромосом, и, таким образом, выявлена возможность в определенной степени управлять этим процессом.

В Мадридском университете (Испания) и Институте селекции общества Макса Планка (Кельн, ФРГ) для озимой ржи разработан метод прямого переноса генов , позволяющий получать трансгенные растения относительно простым способом in vivo, исключающим необходимость регенерации растений из клеточных. Наиболее широко работы ведутся с бактериями Azospirillum (Postgate, 1989). В серии опытов, проведенных в различных штатах Индии, инокуляция семян пшеницы, риса, сорго, проса ризосферными азотфиксаторами обеспечивала прибавки урожая зерна до 30% (Subba Rao, 1982.

Более широкое практическое применение в настоящее время получило другое важнейшее направление современной биотехнологии - клеточная селекция как метод создания новых форм растений путем выделения мутантных клеток и сомаклональных вариаций в селективных условиях. Клеточная селекция является как бы развитием мутационной селекции, но реализуется на уровне единичных клеток с использованием техники in vitro, что придает ей, с одной стороны, более широкие возможности, а с другой стороны - создает значительные трудности из-за необходимости регенерации из отдельных клеток полноценных растений.

Преимущество клеточной селекции перед традиционными методами состоит в:

отсутствии сезонности в работе,
возможности использования миллионов клеток при отборе,
направленности селекции путем применения селективных сред,
выполнении работ в лабораторных условиях

С развитием культуры in vitro появилась реальная возможность более широкого использования гаплоидии в селекции сельскохозяйственных культур. Применение метода культуры клеток позволило осуществить регенерацию растений из генеративных клеток, содержащих гаплоидный набор хромосом. Стало возможным массовое получение гаплоидов. Практическое значение в селекции в настоящее время получили культура пыльников (андрогенез), завязей и семяпочек (гиногенез) и метод гаплопродюсера , который является разновидностью гиногенеза

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

ФГБОУ ВПО

«Оренбургский государственный аграрный университет»

Кафедра технологии хранения и переработки с/х продукции

Реферат на тему:

«Клеточная биотехнология в растениеводстве»

Выполнила:

студентка агрономического

факультета гр. № 21Туманина Я.Д.

Проверила:

Гарипова Р.Ф

Оренбург 2015

Введение

2. Культура каллусных тканей

Заключение

Список литературы

Введение

Биотехнология - наука о генно-инженерных и клеточных методах и технологиях создания и использования генетически трансформированных биологических объектов для интенсификации производства и получения новых видов продуктов различного назначения.

В рамках науки биотехнологии можно выделить 3 основных части:

1. Промышленная биотехнология, где рассматриваются общие принципы осуществления промышленных биотехнологических производств, использующих микроорганизмы. Микробиологическая промышленность в настоящее время использует тысячи штаммов различных микроорганизмов. Некоторые белки и вторичные метаболиты могут быть получены только путем культивирования клеток эукариот. Растительные клетки могут служить источником ряда соединений - атропин, никотин, алкалоиды, сапонины и др. Клетки животных и человека также продуцируют ряд биологически активным соединений. Например, клетки гипофиза - липотропин и соматотропин.

2. Клеточная инженерия - культивирование растительных и животных клеток. Клеточная биотехнология обеспечила получение новых форм и линий растений и животных, используемых в селекции на устойчивость, продуктивность и качество. Например, созданы перевиваемые культуры клеток животных, продуцирующие моноклональные антитела, широко применяемые для диагностики заболеваний. В ветеринарии широко используются культура клеток и зародышей, овогенез in vitro, искусственное оплодотворение.

3. Генная инженерия - перенос чужеродных генов и других материальных носителей наследственности в клетки растений, животных и микроорганизмов, получение трансгенных организмов с новыми или усиленными свойствами и признаками. Позволяет решать коренные задачи селекции биологических объектов на устойчивость, высокую продуктивность и качество продукции при оздоровлении экологической обстановки во всех видах производств.

Клеточная биотехнология базируется на использовании культуры клеток, тканей и протопластов. Для того чтобы манипулировать клетками, нужно выделить их из растения и создать такие условия, при которых они могли бы жить и размножаться вне растительного организма. Метод культивирования изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) получил название культуры изолированных тканей и приобрел особое значение в связи с возможностью использования его в биотехнологии.

1. Культура клеток и тканей высших растений

биотехнология клетка растение гаплоидный

Культуры клеток высших растений имеют несколько сфер применения:

1. Получение биологически активных веществ растительного происхождения: традиционных продуктов вторичного метаболизма (токсинов, гербицидов, регуляторов роста, алкалоидов); синтез новых необычных соединений, что возможно благодаря исходной неоднородности клеточной популяции, генетической изменчивости культивируемых клеток и селективному отбору клеточных линий со стойкими модификациями, а в некоторых случаях и направленному мутагенезу; культивируемые в суспензии клетки могут применяться как мультиферментные системы, способные к широкому спектру биотрансформаций химических веществ;

2. Ускоренное клональное микроразмножение растений, позволяющее из одного экпланта получать от 10000 до 1000000 растений в год, причем все они будут генетически идентичны.

3. Получение безвирусных растений.

4. Получение культуры пыльников и пыльцы используются для получения гаплоидов и дигаплоидов;

5. Тканевые культуры могут производить регенеранты, фенотипически и генотипически отличающиеся от исходного материала в результате сомаклонального варьирования.

История метода

1 этап. Карл Рехингер (1893) выращивал тонкие срезы корня свеклы и одуванчика и сегменты стебля тополя на песке с применением водопроводной воды, без стерильных условий. Г. Габерланд (1902) научился культивировать отдельные зеленые клетки волосков традесканции вирджинской.

2 этап. Гаррисон вырастил нейробласты лягушки в лимфатической жидкости, доказав возможность выращивания in vitro изолированных клеток.

3 этап. В 1922 г. Коттэ начал эксперименты с лишенными пигментов меристематическими тканями - изолированными кончиками корней. Роббинс подобрал состав питательной среды, обеспечивающий в культуре рост апикальной меристемы корня томатов и кукурузы. Эти опыты положили начало культивированию изолированных органов растений на питательных средах.

4 этап. Ф. Уайт и Р. Готре показали, что изолированные органы и ткани могут расти в культуре неограниченно долгое время, если их пересаживать на свежую питательную среду. Были разработаны составы питательных сред, изучено значение микро- и макроэлементов для поддержания нормальной ростовой активности тканей, определено влияние витаминов и стимуляторов роста. Показано значение кинетина и других гормонов для пролиферации клеток in vitro и индукции стеблевого морфогенеза. Изучением этих вопросов занимались такие ученые, как Р. Хеллер, И. Нич, Ф. Скуг, Ф. Стевард, Р. Г. Бутенко.

5 этап. Э. Коккинг в 1960 - 1975 гг. положил начало методу получения изолированных протопластов из тканей корня и плодов томатов. Были разработаны методы гибридизации соматических клеток путем слияния протопластов и введения в них вирусных РНК, клеточных органелл, бактерий. Ведутся работы по переносу генов в растительные клетки и получению трансгенных растений.

Необходимым условием работы с культурой изолированных тканей является соблюдение строгой стерильности. Богатая питательная среда является прекрасным субстратом для развития в ней микроорганизмов, а изолированные от растения фрагменты (экспланты), которые помещают на питательную среду, легко поражаются микроорганизмами. Поэтому надо стерилизовать как эксплант, так и питательную среду. Все манипуляции с изолированными тканями (введение в культуру, пересадка на свежую питательную среду) проводят в асептическом помещении (ламинар-боксе) стерильными инструментами. Стерильность надо соблюдать и во время культивирования изолированных тканей, особенно при перепаде температуры и влажности, так как при этом пробки становятся влажными и по ним в пробирку могут проникать микроорганизмы.

Стерилизацию экспланта, а также семян проводят путем выдерживания их 5--20 мин в стерилизующих растворах с последующей многократной промывкой экспланта стерильной водой. Время стерилизации зависит от характера экспланта и от стерилизующей активности раствора. Обычно семена стерилизуют 10--20 мин, а вегетативные части 5--10 мин. Органы растений, из которых берут эксплант для введения в культуру, предварительно моют мыльным раствором с щеткой и споласкивают дистиллированной водой, а затем погружают на несколько секунд в 70 %-ный этанол. Семена погружают в спирт на 1--2 мин. Кроме собственно стерилизующего действия спирта обработка тканей этанолом перед помещением в основной стерилизующий раствор повышает стерилизующий эффект последнего.

После стерилизации растительные объекты должны быть тщательно промыты стерильной водой.

Поверхностная стерилизация освобождает эксплант только от наружной инфекции. Если же ткани экспланта имеют внутреннюю инфекцию, то его необходимо обработать антибиотиками. Особенно богаты внутренней инфекцией ткани тропических и субтропических растений, имеющих крупные сосуды. Загрязнение культур грибами или бактериями обычно выявляется через 1 --14 дней после посадки. Загрязненные культуры необходимо тотчас же удалить, чтобы избежать заражения воздуха в световой комнате.

Питательные среды стерилизуют в автоклаве при температуре 120° С и давлении 0,75--1 атм в течение 20 мин.

Если в состав питательной среды входят вещества, разрушающиеся при высокой температуре, их подвергают холодной стерилизации, пропуская через бактериальные фильтры с диаметром пор 0,22--0,45 мкм, после чего добавляют в проавтоклавированную охлажденную до 40° С основную среду.

Посуду, предварительно завернутую в фольгу или оберточную бумагу, стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при температуре 160° С в течение двух часов.

Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям макроэлементы (азот, фосфор, калий, кальций, магний, серу, железо) и микроэлементы (бор, марганец, цинк, медь, молибден и др.), а также витамины, углеводы, фитогормоны или их синтетические аналоги. Некоторые питательные среды содержат гидролизат казеина, аминокислоты. Кроме того, в состав питательных сред входит ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или ее натриевая соль, которые улучшают доступность железа для клеток.

Для получения каллусной ткани в отдельных случаях к питательной среде добавляют жидкий эндосперм кокосового ореха (кокосовое молоко), каштана и др.

2. Культура каллусных тканей

Культура изолированных тканей обычно бывает представлена каллусными или реже -- опухолевыми тканями. Каллусная культура -- это неорганизованная пролиферирующая ткань, состоящая из дедифференцированных клеток. В дальнейшем они специализируются как каллусные, т.е. становятся особым образом дифференцированными. Каллус, что означает «мозоль», может образовываться как на изолированных кусочках ткани (эксплантах) in vitro, так и на растении при поранении.

Каллусная ткань in vitro в основном бывает белого или желтоватого, реже светло-зеленого цвета. Очень редко она может иметь интенсивную зеленую окраску (у мандрагоры). Темно-коричневая окраска возникает чаще при старении каллусных клеток и связана с накоплением в них фенолов. Последние окисляются в хиноны. Для избавления от них в питательные среды вносят антиоксиданты.

Каллусная ткань аморфна и не имеет конкретной анатомической структуры, но в зависимости от происхождения и условий выращивания она может быть разной консистенции: 1) рыхлой, состоящей из сильно оводненных клеток, легко распадающейся на отдельные мелкие агрегаты; 2) средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами; 3) плотной, в которой дифференцируются элементы камбия и проводящей системы.

Нормальные клетки в культуре могут существовать в двух видах: в виде суспензии в жидкой питательной среде и на поверхности твердой питательной среды в виде каллуса.

В основе культивирования растительных клеток лежит свойство тотипотентности, благодаря которому соматические клетки растения способны полностью реализовать наследственную информацию, то есть обеспечить развитие всего растения. Следует отметить, что в отличие от животной, растительная клетка предъявляет менее жесткие требования к условиям культивирования. Изменяя условия (добавляя в состав питательной среды те или иные гормоны), можно вызвать дифференциацию недетерминированных клеток.

Условия культивирования. Для успешного культивирования изолированных клеток и тканей растений необходимо соблюдать определенные условия выращивания. Большинство каллусных тканей не нуждается в свете, так как не имеют хлоропластов и питаются гетеротрофно. Исключение составляют некоторые зеленые каллусные ткани, такие, как каллусная ткань мандрагоры. В некоторых случаях каллусные ткани, не способные к автотрофному питанию, все же выращивают на непрерывном освещении, что является необходимым условием дальнейшего успешного морфогенеза, как у люцерны. Большинство же каллусных тканей получают в темноте или при рассеянном свете.

Детерминированные к морфогенезу ткани переносят на свет и далее культивируют их при освещенности 1000--4000 лк.

Культивирование изолированных меристем и их микроразмножение также происходит на свету. Освещенность факторостатной (световой) комнаты должна составлять в зависимости от культуры 1000--10 000 лк. Необходимо учитывать фотопериод, который требуется для данного культивируемого объекта.

Влажность в культуральной комнате должна составлять 60--70%. Более сухой воздух способствует усыханию питательной среды в пробирках и колбах, если они закрыты ватными пробками, изменению ее концентрации и нарушению условий культивирования. Для повышения влажности в комнате можно использовать поддоны с водой.

Оптимальная температура для большинства культивируемых тканей 25--26° С, для культуры тканей тропических растений она может достигать 29--30° С. В случае индукции морфогенеза температуру понижают до 18--20° С.

Наилучшие световой и температурный режимы, а также режим оптимальной влажности можно создать с помощью климатических камер.

Основным типом культивируемой растительной клетки является каллус. Каллусная ткань - один из видов клеточной дифференцировки, возникает путем неорганизованной пролиферации дедифференцированных клеток органов растения. У растений в природе каллусная ткань возникает в исключительных обстоятельствах (например, при травмах) и функционирует непродолжительное время. Эта ткань защищает место поранения, может накапливать питательные вещества для анатомической регенерации или регенерации утраченного органа. Процессу образования каллуса предшествует дедифференцировка тканей экспланта. При дедифференцировке ткани теряют структуру, характерную для их специфических функций в растении, и возвращаются к состоянию делящихся клеток. Если эксплант, используемый для получения каллуса, является фрагментом органа, то имеет в своем составе эпидермальные клетки, клетки камбия, сосудистой системы, сердцевинной и первичной коровой паренхимы. Преимущественно пролиферируют клетки камбия, коры, сердцевинной паренхимы.

Морфофизиологическая характеристика каллусных тканей

Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенной анатомической структуры. В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусные ткани бывают:

Рыхлые, сильно оводненные, легко распадающиеся на отдельные клетки;

Средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами;

Плотные, с зонами редуцированного камбия и сосудов.

Как правило, в длительной культуре на средах, содержащих ауксины, каллусные ткани теряют пигментацию и становятся рыхлыми.

В цикле выращивания каллусной ткани клетки после ряда делений приступают к росту растяжением, дифференцируются как зрелая каллусная ткань и деградируют. Для того, чтобы не произошло старения, утраты способности к делению и дальнейшему росту, а также отмирания каллусных клеток, первичный каллус переносят на свежую питательную среду через 28 - 30 дней, то есть проводят пассирование или субкультивирование каллусной ткани. При пассировании ткани на среду, содержащую индукторы органогенеза, мелкие клетки приступают к делению и формируют меристематические очаги. Деление клеток меристематического очага приводит либо к формированию почек и последующему развитию из них побегов (геммогенез), либо к ризогенезу. Возникновение физиологических и структурных различий между клетками и тканями растений, связанное с их функциональной специализацией, называют процессом дифференциации. Понятие «дифференциация» отражает превращение эмбриональной, меристематической клетки в специализированную.

3. Суспензионные культуры и культуры гаплоидных клеток растений

Суспензионные культуры

Суспензионные культуры - отдельные клетки или группы клеток, выращиваемые во взвешенном состоянии в жидкой среде. Представляют собой относительно гомогенную популяцию клеток, которую легко подвергнуть воздействию химических веществ.

Суспензионные культуры широко используются в качестве модельных систем для изучения путей вторичного метаболизма, индукции ферментов и экспрессии генов, деградации чужеродных соединений, цитологических исследований и др.

Признаком "хорошей" линии служит способность клеток к перестройке метаболизма и и высокая скорость размножения в конкретных условиях культивирования.

Морфологические характеристики такой линии:

· высокая степень дезагрегации (5-10 клеток в группе);

· морфологическая выравненность клеток (небольшие размеры, сферическая или овальная форма, плотная цитоплазма);

· отсутствие трахеидоподобных элементов. Клеточную суспензию получают, помещая каллусную ткань в колбу с жидкой питательной средой.

Культуры гаплоидных клеток растений

Большой интерес для селекционеров представляют гаплоидные растения. Гаплоиды получают:

Методом отдаленной гибридизации, когда в зиготе отдаленного гибрида хромосомы одного из видов элиминируют.

Культивирование in vitro, где из неоплодотворенных половых клеток с редуцированным набором хромосом можно регенерировать целые растения. Обычно они стерильны, так как у них нарушено формирование мужских и женских гамет. При культивировании in vitro, однако, может произойти спонтанное удвоение хромосом, или его можно вызвать искусственно, например, обработав колхицином клетки или растения. Дигаплоиды фертильны и вполне жизнеспособны.

Гаплоиды и дигаплоиды имеют ряд преимуществ в селекционной работе:

· гаплоидные растения имеют один набор хромосом, характерный для гамет, что дает возможность наблюдать мутации сразу же в ходе осмотра гаплоидных растений, поскольку все рецессивные генные мутации в гаплоидных организмах не маскируются доминантными аллелями;

· если гаплоидные клетки подвергнуть полиплоидизации с помощью колхицина, то возникнут дигаплоиды, характеризующиеся абсолютной гомозиготностью. Скрещивание гомозиготных линий дает, как правило, высокопродуктивное потомство;

Наиболее распространены следующие методы индуцирования гаплоидов:

1. индуцированный андрогенез в культуре пыльников и пыльцы. Впервые гаплоидные растения были получены в 1964 году индийскими исследователями С. Гуха и С. Махешвари при культивировании пыльников дурмана. С тех пор таким методом получены гаплоидные растения более чем у 200 видов, в том числе у пшеницы, ячменя, ржи, риса, картофеля и других культур. Культура пыльцы представляет собой культивирование микроспор, освобожденных от соматических тканей пыльника, в жидкой среде.

2. селективная элиминация хромосом в гибридном зародыше. Этот метод чаще всего используется в селекции злаковых. При отдаленной гибридизации некоторых видов установлено явление селективной элиминации хромосом одного из родителей на ранней стадии развития гибридного зародыша. Это явление хорошо изучено у ячменя. При скрещивании диплоидных ячменей Hordeum vulgare (культурный) и H. bulbosum (многолетний луковичный дикий) на стадии роста зародыша и эндосперма (через 5 дней после оплодотворения) происходит выпад хромосом дикого вида. Возникает гаплоид с набором хромосом H. vulgare.

3. псевдогамия - развитие гаплоидного зародыша после оплодотворения инородной пыльцой без оплодотворения яйцеклетки или же развитие изолированной семяпочки (гиногенез).

4. Клональное микроразмножение растений

В природе существует два способа размножения растений: половой (семенной) и вегетативный. Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения - клонального микроразмножения.

Клональное микроразмножение - получение in vitro, неполовым путем, генетически идентичных исходному экземпляру растений. В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность.

Этот метод имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:

· получение генетически однородного посадочного материала;

· освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры;

· высокий коэффициент размножения (105 - 106 - для травянистых, цветочных растений, 104 - 105 - для кустарниковых древесных растений и 104 - для хвойных);

· сокращение продолжительности селекционного процесса;

· ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;

· размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами; · возможность проведения работ в течение всего года;

· возможность автоматизации процесса выращивания.

Пионером клонального микроразмножения считается французский ученый Жан Морель, который в 50-х годах двадцатого века получил первые растения-регенеранты орхидей.

Этапы микроклонального размножения растений

Процесс клонального микроразмножения можно разделить на 4 этапа:

1. Выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры.

2. Собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества меристематических клонов.

3. Укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (+2оС, +10оС).

4. Выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.

На первом этапе необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры. В тех случаях, когда трудно получить исходную стерильную культуру экспланта, рекомендуется вводить в состав питательной среды антибиотики. На первом этапе, как правило, используют среду, содержащую минеральные соли по рецепту Мурасига и Скуга, а также различные биологически активные вещества и стимуляторы роста (ауксины, цитокинины) в различных сочетаниях в зависимости от объекта. Продолжительность первого этапа может колебаться от 1 до 2 месяцев, в результате которого наблюдается рост меристематических тканей и формирование первичных побегов.

2 этап - собственно микроразмножение. На этом этапе необходимо добиться получения максимального количества мериклонов, учитывая при этом, что с увеличением субкультивирований увеличивается число растений-регенерантов с ненормальной морфологией и возможно наблюдать образование растений-мутантов.

Как и на первом этапе, используют питательную среду по рецепту Мурасига и Скуга, содержащую различные биологически активные вещества, а также регуляторы роста. Основную роль при подборе оптимальных условий культивирования эксплантов играют соотношение и концентрация внесенных в питательную среду цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используют БАП в концентрациях от 1 до 10 мг/л, а из ауксинов--ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л.

При долгом культивировании растительных тканей на питательных средах с повышенным содержанием цитокининов (5--10 мг/л) происходит постепенное накопление их в тканях выше необходимого физиологического уровня, что приводит к появлению токсического действия и формированию растений с измененной морфологией.

3 и 4 этапы - укоренение микропобегов, их последующая адаптация к почвенным условиям и высадка в поле являются наиболее трудоемкими этапами, от которых зависит успех клонального микроразмножения. На третьем этапе, как правило, меняют основной состав среды: уменьшают в два, а иногда и в четыре раза концентрацию минеральных солей по рецепту Мурасига и Скуга или заменяют ее средой Уайта, уменьшают количество сахара до 0,5--1% и полностью исключают цитокинины, оставляя один лишь ауксин. В качестве стимулятора корнеобразования используют в-индолил-3-масляную кислоту (ИМК), ИУК или НУК.

Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным условиям является наиболее дорогостоящей и трудоемкой операцией. Нередко после пересадки растений в почву наблюдается остановка в росте, опадение листьев и гибель растений. Эти явления связаны, в первую очередь, с тем, что у пробирочных растений нарушена деятельность устьичного аппарата, вследствие чего происходит потеря большого количества воды. Во-вторых, у некоторых растений в условиях in vitro не происходит образования корневых волосков, что приводит, в свою очередь, к нарушению поглощения воды и минеральных солей из почвы. Поэтому целесообразно на третьем или четвертом этапах клонального микроразмножения применять искусственную микоризацию растений (для микотрофных), учитывая их положительную роль в снабжении растений минеральными и органическими питательными веществами, водой, биологически активными веществами, а также в защите растений от патогенов.

Заключение

Использование культур клеток и тканей во многих работах позволяет проводить параллели между процессами invitro и invivo, моделировать и изучать метаболические процессы вне организменного контроля. Эти системы могут быть использованы как альтернатива природным источникам получения практически ценных соединений, в частности как модель биосинтеза и биогенетических связей в ряду вторичных метаболитов. Много работ проводилось в сфере изучения влияния различных факторов и химических агентов на биохимические и морфологические процессы в культуре тканей и клеток, с последующим переносом этих знаний на природные объекты. С помощью моделей invitro возможно исследование геномных и хромосомных аббераций, изучение роли экзо- и эндофитогормонов (эксперименты по изменению и подбору питательных сред) на характеристики роста и развития растений.

Таким образом, культура клеток растений имеет огромное как практическое, так и фундаметально-научное значение. Безусловно, данный метод будет использоваться и модифицироваться, как удобный инструментбиотехнологической, биохимической и других категорий исследовательской деятельности.

Список литературы

1. Алёхина Н.Д., Балконин Ю.В., Гавриленко В.Ф. Физиология растений М.: Академия, 2005. С. 416-498, 588-593.

2. Сорокина И.К., Старичкова Н.И., Решетникова Т.Б., Гринь Н.А. Основы биотехнологии растений. Культура растительных клеток и тканей. Учебное пособие М.: УМК биологического факультета СГУ им. Н.Г.Чернышевского, 2002. 45 с.

3. Шевелуха В.С., Калашникова Е.А., Дегтярев С.В. Сельскохозяйственная биотехнология М.: Высшая школа, 1998. С. 7 - 66.

4. Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков М.: Мир, 1983. С. 16.

5. Носов А.М. Культура клеток высших растений - уникальная система, модель. Физиология растений. 1999. Т. 46. №6. С. 837 - 844.

Размещено на Allbest.ru

...

Подобные документы

Биотехнология на страже урожая. Биотехнологические аспекты борьбы с возбудителями болезней растений и вредными насекомыми. Получение растений-регенерантов, устойчивых к абиотическим и биотическим стрессовым факторам методами клеточной инженерии.

реферат , добавлен 22.08.2008

Составной частью биотехнологии является генетическая, или генная инженерия. Методы генетической инженерии. Биотехнология базируется на принципах традиционной селекции, заключающихся в приобретении организмами необходимых качественно новых признаков.

реферат , добавлен 24.01.2009

Краткая история развития метода культуры ткани. Терминология клеточных культур. Требования к факторам внешней среды. Питательные среды, солевые растворы. Материалы для приготовления культуры клеток из кожно-мышечной ткани развивающихся куриных эмбрионов.

курсовая работа , добавлен 16.03.2014

Иммунная система рыб представляет собой совокупность клеточных и гуморальных факторов иммунитета и состоит из клеток лимфоидно-макрофагального комплекса (лимфоцитов, гранулоцитов, клеток Купфера, Лангерганса и т.д.).

методичка , добавлен 03.07.2007

Сведения о беспозвоночных вредителях культурных растений и их распространении на различных культурах. Анализ повреждаемости растений на агробиостанции. Средства борьбы: карантин растений, агротехнический, механический, биологический и химический методы.

курсовая работа , добавлен 05.06.2011

Основные направления в интегрированной системе защиты растений как средство повышения урожайности сельскохозяйственных культур. Роль интегрированной защиты растений в охране окружающей среды. Классификация методов, принципы проведения защиты растений.

реферат , добавлен 23.03.2012

Агрохимия – наука о взаимодействии растений, почвы и удобрений в процессе выращивания сельскохозяйственных культур. Цель агрономической химии – создание наилучших условий питания растений. Общие сведения о хозяйстве ЗАО "Бобравское" Рокитнянского р-на.

курсовая работа , добавлен 22.03.2009

Описание основных инновационных научно-исследовательских разработок предприятия в области биотехнологии и их применение. Типы мутаций, причины их возникновения. Изменения признаков организма, вызываемые ими. Их значение для эволюции, селекции и медицины.

отчет по практике , добавлен 23.02.2015

Характеристика защищаемых культур и особенностей их возделывания. Морфологические и биологические особенности овощной культуры. Оценка экономической эффективности при применении пестицидов. Составление фенологического календаря по защите растений.

курсовая работа , добавлен 02.06.2014

Сущность, этапы, основные преимущества клонального микроразмножения. Адаптация растений к почвенным условиям произрастания. Выбор питательной среды и ее основные компоненты. Применение клонального микроразмножения для выращивания декоративных растений.